3细胞生物学研究方法A细胞生物学.doc

第三章第三章细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法20102010-0909-0303IdeaIdea技术技术、方法、方法发现问题形成可验证的假说设计对照试验收集资料解释结果作出合理结论查阅已有知识进行初步观察提出问题引自/m/user_content.aspx?id=355449参照The Scientist Evolution of Science /article/display/57368/内容提要内容提要1.1.显微镜技术显微镜技术2.2.细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法3.3.细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞培养、细胞工程与显微操作技术4.4.其它实验技术其它实验技术11显微镜技术显微镜技术1.11.1光学显微镜技术（光学显微镜技术（light microscopylight microscopy）1.21.2电子显微镜技术电子显微镜技术(electron microscopy)(electron microscopy)1.31.3扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜(scanning tunneling (scanning tunneling microscope )microscope )分辨率分辨率也叫分辨力，指区分开两个非常靠近的也叫分辨力，指区分开两个非常靠近的物体（或点）的能力。物镜决定分辨率物体（或点）的能力。物镜决定分辨率的高低。的高低。通常是用相邻两点间的距离来表示。通常是用相邻两点间的距离来表示。相邻两点的距离越小，说明分辨率越高。相邻两点的距离越小，说明分辨率越高。光学显微镜技术放大倍数：眼睛看到的像的大小与对应标本放大倍数：眼睛看到的像的大小与对应标本大小的比值，取决于物镜以及目镜的放大大小的比值，取决于物镜以及目镜的放大倍数。倍数。反差：指被观察结构不同部位的明暗程度。反差：指被观察结构不同部位的明暗程度。分辨率和哪些因素有关呢？分辨率和哪些因素有关呢？波波长长与与分分辨辨率率D =0.61N.Sin/2：光源波长：物镜镜口角（最大值可达140度）N：介质折射率（空气中为1）最短的可见光为450nm 若在油镜下，N可提高到1.5 ，因此：D=0.2um (光学显微镜最大分辨率)1.1.1 1.1.1 普通光学显微镜技术普通光学显微镜技术.2相差显微镜技术相差显微镜技术.3微分干涉显微镜技术微分干涉显微镜技术.4荧光显微镜技术荧光显微镜技术.5激光共焦点扫描显微镜技术激光共焦点扫描显微镜技术.6荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术.7荧光漂白恢复技术荧光漂白恢复技术光学显微镜技术光学显微镜技术光学放大系统照明系统机械和支持系统目镜物镜光源折光镜聚光镜（滤光片）.1普通光学显微镜技术普通光学显微镜技术目镜物镜集光器载物台光源正置显微镜和倒置显微镜1.1.2 1.1.2 相差显微镜相差显微镜（phasephase-contrast microscopecontrast microscope）发明：发明：19351935年，荷兰物理学家年，荷兰物理学家ZernikeZernike设计和发明相设计和发明相差显微镜，并获得差显微镜，并获得19531953年诺贝尔物理奖。年诺贝尔物理奖。原理：原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构之间的对比度，使标本的各种结而提高了各种结构之间的对比度，使标本的各种结构变得更清晰。构变得更清晰。优点：优点：样品不需染色，可以观察活细胞。样品不需染色，可以观察活细胞。结构结构聚光器或光源上增加一聚光器或光源上增加一环形环形光阑光阑，使透过聚光器的光线，使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本形成空心光锥，焦聚到标本上；上；物镜后装有一块物镜后装有一块“相差板相差板”，相，相差板上涂有特殊物质；差板上涂有特殊物质；偏斜和未偏斜的两组光线之偏斜和未偏斜的两组光线之间增添了新的光程差，从而间增添了新的光程差，从而对样品密度的不同造成的相对样品密度的不同造成的相位差起位差起“夸大夸大”作用；作用；吸光区半透明圆环不透明的涂漆部分透明的环状部分用途：观察未经染色的玻片标本.3微分干涉显微镜技术微分干涉显微镜技术（differentialdifferential-interference microscopeinterference microscope）Nomarski(1952)在相差显微镜原理的基础上发明的：又称Nomarski相差显微镜，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。NomarskiNomarski(1952)(1952)在相差显微镜原理的基础上在相差显微镜原理的基础上发明的：又称发明的：又称NomarskiNomarski相差显微镜，其优点是相差显微镜，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大。DIC显微镜相差显微镜普通显微镜.4荧光显微镜荧光显微镜（Fluorescence Fluorescence microscopemicroscope）特点：光源为紫外线，波特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通长较短，分辨力高于普通显微镜；显微镜；有两个特殊的滤光片；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式。照明方式通常为落射式。应用于对特异蛋白质等生物大分子定性定位。应用于对特异蛋白质等生物大分子定性定位。1）分为：免疫荧光技术荧光素直接标记技术2）原理：（以免疫荧光技术为例）特定抗原（细胞）抗体抗体抗原复合物进行定位测定荧光素激发光不同的荧光素的激发光波长范围不同，所以同一样品可以同时用两种以上的荧光素（如：紫外线）Figure 3-64. Indirect immunocytochemistry. The method is very sensitive because the primary antibody is itself recognized by many molecules of the secondary antibody. The secondary antibody is covalently coupled to a marker molecule that makes it readily detectable. Commonly used marker molecules include fluoresceinor rhodaminedyes, the enzyme horseradish peroxidaseor colloidal gold spheres, and the enzymes alkaline phosphataseor peroxidase. .5激光激光共聚焦共聚焦扫描显微镜技术扫描显微镜技术（Laser ConfocalMicroscopy）原理：原理：是由一个激光扫描显微镜在物镜的成像面上加一个针孔是由一个激光扫描显微镜在物镜的成像面上加一个针孔组成，只有被照亮点发出的光才能通过共焦孔，偏离这组成，只有被照亮点发出的光才能通过共焦孔，偏离这一点的无用的荧光就被排除在最终的图像之外；一点的无用的荧光就被排除在最终的图像之外；通过通过“光学切片光学切片”和计算机进行图像处理得到样品的三维和计算机进行图像处理得到样品的三维结构。结构。效果：效果：使观察到的图像反差和分辨率提高，排除焦平面以使观察到的图像反差和分辨率提高，排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率，可重构样品外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率，可重构样品的三维结构。的三维结构。激光共焦点扫描显微镜的原理图Figure 3-14. Comparison of conventional and confocalfluorescence microscopy. These two micrographs are of the same intact gastrula-stage Drosophilaembryo that has been stained with a fluorescent probe for actinfilaments. The conventional, unprocessed image (A) is blurred by the presence of fluorescent structures above and below the plane of focus. In the confocalimage (B), this out-of-focus information is removed, which results in a crisp optical section of the cell in the embryo.1.1.6荧光共振能量转移技术用于检测细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。1.1.7荧光漂白恢复技术荧光标记蛋白激光照射淬灭恢复FRAP光镜样品制备光镜样品制备取材：取材：固定：固定：用甲醛或乙醇用甲醛或乙醇包埋：包埋：石蜡石蜡切片：切片：11-1010umum染色：染色：不同的染料对某种细胞组分有特异的吸附不同的染料对某种细胞组分有特异的吸附观察观察电子显微镜技术电子显微镜技术(electron microscopy)(electron microscopy)19321932年德国学者年德国学者Max Max KnollsKnolls和和Ernst Ernst RuskaRuska用用波长比光短得多的电子波长比光短得多的电子作光源作光源,发明了第一台发明了第一台电子显微镜，大大提高电子显微镜，大大提高了显微镜的分辨率，开了显微镜的分辨率，开拓了超微世界。拓了超微世界。駨駨透射电子显微镜（透射电子显微镜（transmission transmission electron microscope, TEMelectron microscope, TEM）駨駨扫描电子显微镜（扫描电子显微镜（scanning electron scanning electron microscope, SEMmicroscope, SEM）饨饨以以电子束电子束作光源，作光源，电磁场电磁场作透镜。电子束的波长短，并且作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压波长与加速电压(通常通常50120KV)50120KV)的平方根成反比。的平方根成反比。饨饨由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等统、电源系统等55部分构成。部分构成。饨饨分辨力分辨力0.2nm0.2nm，放大倍数可达百万倍。，放大倍数可达百万倍。饨饨用于观察超微结构（用于观察超微结构（ultrastructureultrastructure），即小于），即小于0.20.2mm、光学、光学显微镜下无法看清的结构，又称显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构亚显微结构（submicroscopic structuressubmicroscopic structures）。）。.1透射电子显微镜透射电子显微镜transmission electron microscope, TEMtransmission electron microscope, TEM透射电子显微镜扫描电子显微镜scanningelectron microscope，SEM工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。级电子信号。Figure 3-32. Cells in culture. Scanning electron micrograph of rat fibroblasts growing on the plastic surface of a tissue-culture dish.CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题.3电镜制样技术电镜制样技术超薄切片技术超薄切片技术固定：锇酸（OsO4）和戊二醛等；包埋：环氧树脂；切片：染色：重金属盐；Electron micrograph of a root-tip cell stained with osmium and other heavy metal ions. The cell wall, nucleus, vacuoles, mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgiapparatus, and ribosomesare easily seen. 电镜负染技术用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。亦称冰冻断裂亦称冰冻断裂(freeze(freeze-fracture)fracture)，是研究生物，是研究生物膜内部结构的一种有用的技术，关于膜结膜内部结构的一种有用的技术，关于膜结构的许多资料即是利用这种方法取得的。构的许多资料即是利用这种方法取得的。冰冻断裂技术也是研究细胞内部各种细胞冰冻断裂技术也是研究细胞内部各种细胞器结构的有用手段。器结构的有用手段。冷冻断裂冷冻断裂蚀刻技术蚀刻技术细胞冰冻断裂后的电镜图像细胞冰冻断裂后的电镜图像利用样品对光的吸收形利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差和