研究生学位论文开题报告-腈水合酶酶学性质、结构、功能.doc

研究生学位论文开题报告姓 名导师姓名专 业所属学院学 号类 别硕士博士硕博连读论文选题研究方向生物制药技术题目名称Rhodococcus rube.CGMCC309菌株产生的多功能腈水合酶酶学性质、结构、功能及其基因蔟结构的研究性质（）基础理论研究（） 应用性研究（ ） 开发性研究（ ）类 别国家项目（ ） 合作项目（ ） 省（部）项目（ ）自选项目（） 其它项目（ 项目）姓 名职 称工作单位及职务签字组长评审组成员成绩（ ）票同意 （ ）票不同意评价（通过 or 否） （学院盖章）报告日期： 2010 年 月 日1、 拟选课题背景及其研究意义：1.1选题背景利用微生物催化腈化物的水解具有高选择性、高效性、条件温和、环境污染小、成本低、产物光学纯度高等优点，符合原子经济和绿色化学的发展方向，有着化学方法无可比拟的优越性。2007年，本实验室以葡萄糖为碳源，逐步增大培养基中丙烯腈浓度重复续代培养，从土样中筛选到一株腈水合酶活力较高的菌株ZH8。经形态观察和16S rDNA序列比对分析确定菌株ZH8属于Rhodococcus1，序列号EU167912。对菌株ZH8培养条件进行了优化，腈水合酶活力达892.46U/mL，与优化前相比提高了108%。后命名为Rhodococcus spTCCC 280012。不同金属离子对该菌株生长及其腈水合酶的酶活有着不同程度的影响。其产生的腈水合酶是钴型3，且Co2对该腈水合酶诱导激活的最适浓度为1010-5molL。在1010-5 molL Co2诱导激活下，Fe2,Mn2,Mo6,Cu24种金属离子对酶具有促进作用，Zn2对酶有轻微抑制作用。610-5molL Fe2的促进效果显著，使菌株TCCC 28001的酶活增加到1941UmL。经16S rDNA序列测定及系统发育分析鉴定该菌为Rhodococcus ruber4。通过对其培养过程中pH的调控，尿素的加入时间的研究，使Rhodococcus ruber TCCC28001培养72 h后丙烯腈水合酶比活力达到4628 U/mL。考察了底物对腈水合酶活性及丙烯腈转化的影响，底物浓度20%对腈水合酶活性无抑制作用，丙烯腈转化率达100%，表明该Rhodococcus ruber 菌株对底物有较强的耐受性。研究发现5，该菌株能以高活性将丙烯腈转化成丙烯酰胺。使用脂肪腈，芳香腈，杂环二腈作为底物测试了腈水合酶的活性，所有腈类化合物都能被静息细胞水合。得到的主要酰胺产物暗示在该菌株中可以产生丰富的腈水合酶，有间接地单水合作用。特异的转化效率以下列顺序呈下降趋势：丙烯腈，烟腈 ，戊腈 ，己二腈，2,3,4,5,6-五氟苯腈，对羟基苯乙腈，3-吲哚乙腈，邻苯二甲腈。说明对脂肪腈转化能力更高菌株有广泛底物作用范围，基于16S rDNA序列分析最终鉴定并命名为为Rhodococcus ruber CGMCC3090。总之，该菌株具有较宽的底物特异性，并对脂肪腈具有较高的转化能力因此具有很大的研究价值。1.2研究意义由于菌株对腈类物质的区域选择性较好，对底物的适应性广泛。但目前该菌株所产的腈水合酶的结构尚需研究阐明，因此本研究试图对该菌株的腈水合酶进行深入的研究，提取和纯化Rhodococcus rube.CGMCC309菌胞内腈水合酶；对酶进行结晶，探索和优化结晶条件；将酶的晶体进行X射线衍射分析，最终阐明酶的结构和功能的关系。通过基因工程的方法研究净水腈水合酶的基因序列，并同其他微生物腈水合酶基因进行比对。在此基础上，深入探讨该腈水合酶的酶学性质和催化机制。2、本课题研究领域在国内外的研究动态及发展趋势：2.1腈水合酶理论的研究动态及发展趋势 腈水合酶(NHase; E.C.4.2.1.84)催化腈的水合作用转变成相应的酰胺。酰胺然后经酰胺酶(E.C.3.5.1.4).转化成羟基酸。这组酶之所以受到广泛的研究主要是因为它们作为催化剂成功地应用于大规模的商业生物转化之中，由Nitto化学公司进行的大规模的工业化转化生产（6000t/年）。 这一成就的取得是由于使用了来自Pseudomonas chlororaphis B23菌株的腈水合酶6 。使用Rhodococcus rhodochrous J1产生的腈水合酶，这一过程进一步改进，使得年产丙烯酰胺达30000吨以上7。另一个方面他们对环境生物修复具有潜在的应用价值。生物催化优于传统方法的优势8,9有很多，对环境更加友好，使合成产量更高，并具有化学、区域和立体选择性，在更加的温和的反应条件下进行的特点。2.1.1 腈代谢酶的发现、分布和分离许多微生物菌株可以经亚乙基羟胺水化酶作用下，代谢催化亚乙基羟胺10。亚乙基羟胺是合成天然产物的中间体。亚乙基羟胺水解酶基因像腈代谢酶（腈水合酶和酰胺酶）一样，具有同样基因蔟和操纵子。该途径的作用是分流亚乙基羟胺进入中心能量代谢机制。在 Pseudomonas chlororaphis B23菌株中，相同基因蔟内部乙酰辅酶A合成酶的存在已经巩固了这一假说11。因此，完整的腈途径（亚乙基羟胺，腈，酰胺，羟基酸，乙酰辅酶A）很可能负责允许微生物使用亚乙基羟胺作为碳源。已经证实在不同属（Agrobacterium, Arthrobacter, Corynebacterium, Pseudomonas and Rhodococcus）的若干细菌种中都含有腈水合酶存在，并在多样的生态系统中得以分离，例如，热湖的沉积物、深海沟渠、腈污染的土壤。这些微生物大多是专性适温性的。到目前为止，仅报道有5个嗜热的腈水合酶。第一个就是来自一种放线菌Pseudonocardia thermophila JCM 3095 12。随后，所有其他的热稳定性腈水合酶普遍来自于嗜热杆菌菌种Bacillus smithii SC-J05-1 13 Bacillus sp. RAPc8 14 Bacillus pallidus DAC 521 15 和Bacillus sp. BR449 16 在有限的几个真菌菌属中，已有腈类降解活性的报道17。嗜热腈代谢酶的分离主要依赖于经典筛选和富集分离策略。典型地用丙烯腈和丁腈作单一的碳源和氮源，和（或）作为初级和次级筛选途径中的底物。例如，对于Bacillus smithii SC-J05-1而言，控制铵和甘油的浓度对酶产量的优化是必要的18。而且为了腈水合酶活性最大的发挥，在生长培养基和次生筛选实验反应中有必要提供所有需要的辅助因子。尽管经典的分离方法已经很成功，但它们不是没有限制的。最近，意在分离新腈水合酶的研究已经使用宏观基因组学19作为新的方法，新的腈水合酶已经通过PCR扩增靶基因得以分离20,21,22，这些基因取自于群落DNA或者是从宏观基因组制备的文库。一些腈水合酶以活性形式成功表达。2.1.2 腈水合酶在大肠杆菌的功能表达已经广泛被证明，微生物腈水合酶能够在大肠杆菌中异源表达。克隆腈水合酶在大肠杆菌中表达可以获得大量的酶蛋白，为研究酶的特性提供了机会。在大肠杆菌中表达可以使用现代生物学技术，例如定点进化和位点突变技术以改善酶的特性，在生物技术的应用上有重要意义。功能蛋白在大肠杆菌中过表达已经很好地建立起来，不同标准的表达和表达的优化途径也早已有论述23,24。研究表明，源于Pseudomonas chlororaphis B23菌株的腈水合酶操纵子的内源启动子在大肠杆菌中是没有功能的。早期在大肠杆菌中表达克隆腈水合酶的目的很少有成功，这是由于会形成无活性或者不溶的以包涵体形式存在的酶。在30-32培养生长和诱导表达，而不是在最佳培养温度37下生长，某种意义上可以成功地减少包涵体形成。同时显示在培养基中存在适当的金属离子辅助因子时，对有活性的重组腈水合酶的生产具有重要意义。腈水合酶基因与不同的激活子蛋白共表达已经显示了可以改善重组酶的比活力25,26,27。这些激活子蛋白基因一般被发现仅处于编码腈水合酶亚基的下游，并在同一基因簇内部，大小和序列各异。在Pseudomonas putida 5B菌株内，为了使腈水合酶基因表达需要一个下游的开放阅读框，以编码一种14KDa (127 个氨基酸)的蛋白质，即所谓的P14K。这种蛋白在蛋白质数据库中与任何序列都很少有同源性25 。Cameron等人发现27来自于Bacillus sp. RAPc8菌株的腈水合酶与同源性的蛋白质共表达，对于完全的酶活性是必要的。与Bacillus sp. BR449菌株需要一种编码大小大约在12KDa的蛋白质存在相比28，嗜热腈水合酶在大肠杆菌中表达时不需要附加蛋白的存在。这些小的激活子蛋白确切作用尚不很清楚，有人认为他们可能是专门用于活性位点的后转录加工。其他的已经发现能促进腈水合酶在大肠杆菌中活性的激活子蛋白暗示与金属离子进入酶或宿主细胞有关。大肠杆菌缺乏将钴离子转入细胞机制。已经证明在产腈水合酶Rhodococcus rhodochrous J1菌株中存在一个新的钴转移装置29。37KDa膜蛋白基因在腈水合酶操纵子内部，且位于编码腈水合酶亚基的基因的下游。结果显示在大肠杆菌和R. rhodochrous ATCC 12674菌株中，腈水合酶与这些蛋白的共表达能导致更有活力的腈水合酶表达。在腈水合酶的组装过程中有一种想象出来的类似P14K的分子伴侣存在。目的是证实这种假说的进一步工作最近正在进行中(Cameron R.A., unpublished results)，但是值得注意的是，Comamonas testosteronii NI1菌株腈水合酶与大肠杆菌GroEL/GroES系统共表达在酶活力方面也有类似的进展。2.1.3 腈水合酶酶学性质腈水合酶是可溶性酶，基于其所需要的辅因子不同分成两个类群，铁型腈水合酶30,31和钴型(Co-type)腈水合酶32,33。大多数腈水合酶的最小的功能单元由两个亚基组成，还包括一个金属离子单位。迄今为止，至少有两个已经被描述的酶有同型二聚体功能单元，以2表示(Agrobacterium tumefaciens34 (Trott et al., 2001) 和Corynebacterium sp. C5 35 (Yamamoto et al.,1992)，一个有一个单体功能单元。不同亚基和的大小范围从23kDa到30kDa不等。天然分子量在30kDa36（Rhodococcus equi SHB-121菌）和500-530kDa37（ Rhodococcus rhodochrous J1之间。这样腈水合酶就分成了轻型腈水合酶(L-NHase)和重型腈水合酶(H-NHase)，特别是来自于Rhodococcus rhodochrous J1.的酶。几个腈水合酶的晶体结构已经阐明（Rhodococcus sp. R312，程序数据库登陆号38为1AHJ/2AHJ；Rhodococcus sp. N-77139,Nagashima et al.，1998；Pseudomonas thermophila，程序数据库登陆号40为1IRE， Miyanaga et al.，2001；Bacillus smithii SC-J05，程序数据库登陆号41为1V29，Hourai et al.，2003)。所有这些酶大体折叠层次是保守的。第一个细致描述的腈水合酶结构，分辨率是2.65，报道于1997年(Huang et al., 1997)。这个酶属于铁型亚群。酶的亚基由一个长的延伸的N-端臂和一个球状的C-端结构域组成。这个C-端的球状结构域很不寻常，详细的有4层结构，即-。亚基以30个氨基酸残基的长环开始，在双体内将亚基包缠起来。随着是5个螺旋结构域，跟着是一个由6个反平行链组成圆环。Rhodococcus sp. R312的腈水合酶的和亚基形成了一个紧密的二聚体结构，带有一个很大的3800 2内表面积。铁中心位于内部表面积中的一个大的开放洞穴内部，与金属离子配位的蛋白配基由亚基提供。cys110, cys113, cys115的侧链和ser114and cys115残基的主链酰胺氮原子形成了配体球。在晶体结构中观察到的配体球是这样的形式S3N2X，带有5个一致的配体，占据八面体的5个顶点。第6个位置（由X代表）被推测是一个氢氧化合物或水分子以酶的活性形式存在和一氧化氮以酶的非活性形式存在42。来自于保守残基arg141和arg56的胍基同来自于cys115和 cys113的硫原子形成氢键，这样就保正了他们的正确的位置。来自Rhodococcus sp. N-771菌株的另一个铁型腈水合酶43 (Nagashima et al., 1998)表明cys114 and cys112（相当于Rhodococcus sp. R312菌株的cys115和cys113 ）是转录后各自被修饰成半胱次磺酸和半胱亚磺酸。在这个酶中，arg141和 arg56同这些修饰的半胱残基的氧原子形成氢键。现已表明，亚基的Val-Cys-Ser(Thr)-Leu-Cys-Ser-Cys序列形成了金属结合模型（即爪状模型），在所有腈水合酶中44都具有高度的保守性。钴型腈水合酶有一个苏氨酸替代了铁型腈水合酶的丝氨酸。这种取代方式一般认为是对于不同的辅因子有不同的偏好。由金属离子占据的开放洞穴接近弥散的溶胶中，被认为是酶的可能的活性位点。这种观点已经受到了底物类似物(碘乙腈)进入Rhodococcus sp. R312菌株(Huang et al.,1997)晶体结构的活性位点口袋成功模拟的支持。根据这种模型已经提出了三种不同的催化机理。所有机制都需要金属离子充当路易斯酸作用激活腈的水合反应。由于不需要配体交换，一般认为，这种机制最可能是腈的间接性激活。三价离子的配体交换十分缓慢，致使此机制很少受到欢迎。现已阐明45R. rhodochrous sp. J1菌株的钴型腈水合酶与Rhodococcus sp. R312菌株的铁型腈水合酶在相同的反应条件下，水解丙腈的反应效率几乎一致。由于低自旋铁(III)和钴(III)的配体交换动力学特征明显不同，这两种酶类似反应性质暗示这些酶反应机制不需要配体的交换。在由黄等人推崇的机制中，即所谓的外球体机制，有一个氢氧离子充当一般的碱在活性位点激活水分子，这样的水分子反过来攻击腈。已经报道嗜热菌株Pseudonocardia thermophila JCM 3095的钴型腈水合酶晶体结构46。该结构（分辨率：1.8）显示与适温腈水合酶有很高的结构相似性。然而两种酶的明显区别在于P. thermophila腈水合酶的和亚基之间有附加的相互作用，这是由两个额外的螺旋引起的，这表明这种额外的相互作用很可能有助于酶的热稳定性。钴型腈水合酶的活性中心（金属结合位点）像铁型酶一样有相同的爪状模型，与钴离子配位的配体是由cys108 , cys111 and cys113残基的硫原子和ser112 and cys113 的主链酰胺氮原子之间形成的。电子密度峰指出cys111 and cys113在转录后分别氧化成半胱次磺酸和半胱亚磺酸，这已经确定无疑47。在Rhodococcus sp. N-771腈水合酶48中，由于来自这些修饰的半胱氨酸残基和来自亚基(arg52 and arg157 )的保守精氨酸残基之间形成氢键，这样就稳定了爪状模型。2.1.4 铁型腈水合酶的光激活性质来自于Rhodococcus sp. N771, Rhodococcus sp. N774, Rhodococcus sp. R312, R. erythropolis and C. testosteroni的铁型腈水合酶已经显示对光具有独特的反应活性。Rhodococcus sp. N771的光反应活性近期已经有广泛的综述 (Endo et al., 2001)。早期的理化研究涉及到光反应活性中的铁中心49 在光反应前后测量不同的傅里叶变换红外光谱学为解决光反应活性机制提供的最可靠数据50。最终光谱分析指出在黑暗中内源NO分子结合，而在暴露于光的时候解离。光照射下NO的分离导致活性中心的构像改变，促使底物的结合。光激活的物理学意义尚不清楚。2.1.5 最适温度与最适pH在不同的微生物中，最适温度和热稳定性不同。纯化的酶活性的最适温度和原始微生物的最适生长温度具有典型的一致性。一般而言，钴型腈水合酶比铁型腈水合酶具有更高的热稳定性51。对来自Pseudonocardia thermophila的热稳定钴型腈水合酶详细结构研究表明52额外的-亚基与亚基间的的相互作用，很可能有助于该蛋白质的热稳定性。研究已经表明粗提的嗜热菌Bacillus pallidus腈水合酶比纯化的酶的热稳定性高很多53。这说明这种嗜热菌的细胞内环境提供了一个高水平的外部稳定性。迄今所描述的腈水合酶的最适酸碱度为pH6（Pseudomonas chlororaphis)腈水合酶的最适范围的最低限 (Takashima et al., 1998)和pH10.5(Bacillus smithii NHase菌株最适范围的高限(Takashima et al., 1998) 54。已知腈水合酶的酸碱度在酸、中性和碱性之间。2.1.6 底物特异性通常说腈水解酶有芳香底物特异性和区域选择性，而腈水合酶具有脂肪底物特异性而缺乏区域选择性，随着更多的腈水合酶的鉴定和描述，一些具有芳香底物特异性和（或）具有区域选择性，这种观点即不攻自破了。Rhodococcus rhodochrous AJ270菌株的底物特异性已经得到了详细的研究55尽管研究中不是使用纯化的酶，但作者能够阐述在该有机体中，具有优势的腈代谢系统是腈水合酶/酰胺酶系统。有机体能够广谱地水解饱和和非饱和的脂肪腈和芳香腈以及杂环腈。研究也显示，该酶对底物分子的几何学是敏感的，特别地在芳香腈中存在芳香胺时候更是如此，分子半径小于7 是腈类有效水解的上限。在5个已知的腈水合酶中，三个酶的底物特异性已经进行了仔细地研究。Bacillus pallidus DAC 521 56, Bacillus sp. RAPc8 57,58和 Bacillus smithii SC-J05-159,60对于Bacillus sp. BR449腈水合酶没有可以利用的底物特异性数据。尽管这种酶显示了对商业上的重要底物丙烯腈有活性。尽管仅仅测试了4个腈类底物，很明显来自Pseudonocardia thermophila的腈水合酶对脂肪腈61似乎特别有偏好。当各种酶所研究的腈的范围不同时，可以采用不同的测试方法。这些数据表明，Bacillus sp. RAPc8腈水合酶有最广泛的底物特异性而Bacillus smithii and Bacillus pallidus腈水合酶的底物特意性相对受到限制。而我们分离的红球菌Rhodococcus rube.CGMCC309有广谱的底物作用范围不但作用于脂肪腈和芳香腈，而且对二腈具有区域选择性。2.2 腈水合酶应用的研究动态及发展趋势人们之所以对腈代谢酶类有广泛研究兴趣的主要原因是它们作为催化剂，将腈类物质变成更有价值的酰胺和羧酸，成功地应用于工业转化。实际上，Mitsubishi Rayon (Kyoto, Japan)每年使用Rhodococcus rhodochrous J1菌株生产公吨级的丙烯酰胺是工业催化剂上商业性成功的最令人瞩目的例子62。另一个腈代谢酶的工业应用的例子是由广州沙龙精致化工基团推出的尼克酰胺63的区域化生产(Guangzhou, China) (Thomas et al., 2002)。已经证明使用Pseudomonas chlororaphis B23菌株进行工业规模的己二腈(ADN)向5-氰基戊酰胺(5-CVAM)的转化，并接近大规模的工业开发生产64。5-CVAM是(DuPont)公司生产azafenidin除草剂的前体物质。化学上生产5-CVAM是使用雷尼铜或二氧化锰作催化剂，需要130高温。这种方法的主要缺点是会产生有相当量已二酰二胺副产物。使用具有理想区域选择性的P. chlororaphis B23菌株固定化细胞，使副产物已二酰二胺的产量达到最小化。化学催化剂的方法更大的缺点是产生大量的催化废物。相比之下，利用P. chlororaphis菌株的方法，生产每公斤5-CVAM仅仅有0.006 kg的催化废物产生。固体催化废物仅占7%。这种新的途径对环境更加友好。D-苯甘氨酰胺是工业上合成-内酰胺抗生素的一种中间产物。Wegman65分离到一个新种Rhodococcus sp.（与R. globerulus典型菌株紧密相关）能够使苯氨基乙腈外消旋体混合物转化为D-苯甘氨酰胺和L-苯甘氨酰胺。这种有机体具有一个腈代谢系统，由一个非立体选择性的腈水解酶和极好的L-选择性的酰胺酶活性组成。带有类似的立体化学性的可以进行脂肪和芳香腈转化的有机体前面已有报道66。这种红球菌是一种新种，它能够在底物浓度很高时保持一种高的酶活力，高酶活性最大限度地减少了将苯氨基乙腈分解成安息香醛和铵的水平67。2-芳基丙酸是十分重要的抗炎药物。这些药物的(S)-对映体显示出比(R)- 对映体更具有活性。通过物理方法进行异构体拆分的化学合成途径价格昂贵，商业化不理想。已经发展起来的光学活性2-芳基丙酸制备的策略之一就是用对映选择性酶水解相应的腈类物质68。可以使用Rhodococcus sp. C3II细胞将外消旋体(R/S) 甲氧萘丙腈变成(S)-甲氧萘丙酸。该菌株能表达组成型(S)-对应体特异性的腈水合酶(NHase)和酰胺酶69。从而显示Rhodococcus sp. C3II 和 R. erythropolis MP50菌株能够分解多种其他类型的底物，导致产生多种其他类型的2-甲氧萘丙酸。现发现这两种菌对二腈和二酰胺的生物转化有互补关系，Rhodococcus sp. C3II选择性地产生单腈和单酰胺衍生物，而R. erythropolys MP50菌株更偏爱产生单腈，单酸和单酰胺衍生物。(Effenberger and Graef, 1998)使用Rhodococcus sp. AJ270 70.菌株已经确定可以进行 (S)-布洛芬的酶学生产。自从其分离出来，Rhodococcus sp. AJ270已经被证明是十分强悍的多功能催化剂。具有非常广阔的底物特异性。例如，(Wang and Feng, 2000)报道71，外消旋体2-环丙烷腈类化合物生物转化导致形成致对映纯的不同重要药物环丙基化合物制备Rhodococcus sp.AJ270也成功地用于生产光学活性的L-芳基甘氨酸和D-芳基甘氨酰胺(Wang et al., 2001)。腈水合酶也用于类固醇的生物转化73 (Kaufmann et al., 1999)。衍生于去甲睾酮的黄体激素-地诺孕素是一种激素性避药。为了发展这种化合物用于其他方向，提高效能。Rhodococcus erythropolis被用于转化17位的腈甲基基团形成酰胺和羧酸衍生物。 (R)-2-萘基芳氧气基本乙酸在分析次级醇类的绝对构型时，是有用的分子对称性的核磁共振的试剂。这种分子典型的外消旋物是通过化学的方法合成，然后通过色谱将对映体加以分开。最近Kimura et al. (2002)报道了一种对(R)-2-萘基芳氧气基本乙酸整合的化学酶催化途径。在所利用的步骤中利用Rhodococcus rhodochrous IFO 15564对氰基加以水合作用。2.3 生物大分子的X射线衍射技术研究动态和发展趋势X射线晶体学是目前阐明生物大分子晶体结构的可选择方法。在蛋白质数据库(PDB)已经发表的33252种结构中，28250 (85%)种是使用X射线晶体学确定的。从目的基因的克隆到相位的计算到最终结构的精炼的必要技术的改善使众多实验室都可以加以利用73,74。一旦X射线衍射数据被收集到，就可以提供一种蛋白质结构确定必要步骤的简明方法75,76,77。广泛使用的方法包括计算机程序。X射线衍射数据被收集，蛋白质结构确定方案的不同步骤。首先要确定该晶体属于的空间基团和晶体系统（包裹对称性晶体）。这些过程也包括精确确定晶体的晶胞尺寸和在X射线光柱下晶体的定位方向。这项工作完成之后，数据可以编入索引，简而言之，索引即是这样一个过程，在此过程中数据集内衍射图像上所有点都分配成一个由三个整数h, k and l所描述的米勒索引。然后测量点的强度并与来自数据集的所有图像建立相互关系。所有方案都使用带有来自研究者相互干预的计算机程序。一般用于此目的所使用的程序是Mosflm and SCALA (CCP4, 1994), Crystal Clear (d*TREK) 78 (Pflugrath et al., 1999) and HKL2000 (incorporating Denzo and Scalepack) 79 (Minor et al., 2002)。数据处理的结果是得到一个描述一系列索引的强度文件，给定的衍射点的强度是衍射波的振幅和相对位相的结果反映。在晶体学试验中，振幅是可以计算的，但是相位不能直接计算。这种晶体学实验的特性导致了大分子晶体学相的问题。一旦相位得以计算，结构因子就会相对容易算出，这些多可用经傅立叶转换计算出分子内电子分配图。同成功的制备出用于分析的晶体一样，在大分子结构确定方面，相位的计算被认为是的最大的障碍。采用什么方法计算来自晶体学数据的相位，要依赖有没有可以利用的紧密相关的大分子结构。通常一个适当的同系物可以作为研究模型加以使用。由于这个原因，分子置换技术现在已广泛采用80 (Rossmann, 2001)。在分子置换中，有必要借助来自研究模型的相位信息，用于新结构的预测。已知同系物结构的结构因子要接受反相傅里叶转化以及获得的相位的考验。这些相位被用于作为实验数据相位的评估。为了使这种方法有用，研究模型一定要以正确的位置和方向放进未知结构的晶胞中。对这正确位置和方向的六维研究，要在两个独立的三维步骤下进行，即滚动功能和平移功能。来自于实验所观察到的振幅，以及这些新估计的相位，要接受傅里叶转化以计算出新结构的结构因子。一般使用计算机程序通过分子置换的方法包括Amore81 (Navaza, 2001), Molrep82 (Vagin and Teplyakov, 1997), EPMR 83 (Kissinger et al., 1999) BEAST 84 (Read, 2001) and Phaser85,86 (Storoni et al., 2004; McCoy et al., 2005) 来对结构进行解析。在缺乏同系物结构时，一定使用实验性的或所谓从头开始的相位处理方法。使用的最一般的实验相位技术是复合同型置换方法(MIR) 87和多波长不规则散布方(MAD) 88。实验相位技术需要在大分子内存在重原子，在这两种技术中这种衍生过程是不同的。在MIR中，重金属原子通过渗透和共结晶与晶体合并，在重金属试剂的低毫克分子溶剂中。一般的选择汞，铂，金89。卤化物90也用来衍生晶体。在MAD中，硒代甲硫氨酸从遗传学角度可以与大分子合并，一般代替出现的蛋氨酸残基91。MIR依赖于完善的来自于原始和衍生晶体的同晶形现象。重原子的位置可以以这样一个事实为基础加以确定：即两个数据集之间的主要区别不是因为构象的变化和晶体中晶胞尺寸的不同，而单单是因为合并了重原子的结果。在大分子中重原子的位置的确定和精炼是相位计算的起点。近来，由于专用同步加速器的日趋有效应用，MAD方法得以相对广泛的利用92。在合并入晶体的硒原子吸收边缘附近的几个波长下的衍射数据被收集到，然后从这些数据中计算出MIR中获得的类似相位信息。来源于实验的相位的电子密度图谱，在图谱能够准确解释之前，有必要更改和完善。实验相位程序包有SOLVE/RESOLVE 93 和SHARP/autoSHARP。一旦有一个可以说明问题的电子强度图谱绘制出来，结构就能以坐标形式得以构建，用以描述适合电子强度图谱的原子和键的模型。手工模型建立或拟合过程，可以在计算机程序辅助下进行。例如使用O 94 (Kleywegt and Jones, 1997), XtalView (McRee, 1999), coot (Emsley and Cowtan, 2004)和NOC。来自于高分辨率数据的结构甚至可以通过程序自动化得到构建，例如使用ARP/wARP95程序。然后精炼结构，改善原始衍射数据和结构模型之间的拟合。实际上，拟合和精炼步骤一般要循环几次进行，在成功模型建立和精炼结束时，结果应该是获得这样一个模型，即它足可以解释实验所观察的数据，而且能够给出物理，化学和生物学意义96。通过计算R-因子和自由R-因子(Rfree) 基本可以测得实验是否成功97。简而言之，这些值是在所计算的结构因子（来自模型）和观察到的结构因子（来自原始衍生数据）之间的差别的测量。然而，Rfree的计算源于一小部分数据，这些数据已经从精炼处理步骤中（测试集合）排除掉了。它被用作比R-因素更可靠的交叉的有效性验证指示器。目前使用的一些用于精炼处理的程序有Refmac5 98, ARP/wARP99 X-plor/CNX (Accelrys Ltd.)。一旦得到最终的精炼模型，为了检验它的可靠性必须使用其他的有效性工具。为此目的，PROCHECK 100似乎是最广泛引用的程序。这一程序检验结构的空间完整性，作为一个结果，它可以产生详细的构象图的点集。为此目的可以选择的程序还有WhatIf and RAMPAGE 101。一个完全精炼的，可靠的结构模型易于进行广泛的分析，并储存于三维蛋白质结构数据库(PDB)中102,103 。晶体结构分析可能包括大量分析方法的任何一个组合（例如，可接近的表面分析，洞穴分析，拓扑分析，接触面分析），需要许多程序。这些程序，尽管非常有限，其特殊功能在这里也不可能叙述完全，然而不变的是，结构分析需要使用分子几何学程序，来帮助实验者以不同的方法观察和揭示结构。为此，为模型构建所设计的所有程序（如上面所提到的）都是有效力的。目前所使用的许多分子几何学程序也包括Rasmol, Swiss-PDBviewer 104, Cn3D, Chime, PyMol 和 MolScript 105。目前腈水合酶的研究日渐深入，在培养基的优化，菌种多用性的鉴定以及基因克隆以及酶分子以及底物分子的对接方面都有进展。2005年有人106筛选出来40个酵母菌株具有腈水解活力，其中耐温鹰嘴豆孢克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans MGBY37)显示了最高的腈水解能力（0.03mol/h/mg细胞干重）。这种酵母包含两种酶系统，即腈水合酶（NHase,EC4.2.1.84）和酰胺酶（EC 3.5.1.4）水解腈和酰胺形成酸和氨。然而，这些酶对N-杂环和芳香腈和酰胺比不饱和及饱和脂肪腈和酰胺有更好的亲和力。腈水合酶和酰胺酶是由Kluyveromyces thermotolerans MGBY37菌株组成型产生。在培养基中加入丙腈能够提高酶的活力，而其他的腈和酰胺会降低腈水合酶和酰胺酶的活性。这种有机体显示了两种类型的酰胺酶活性，即组成型的酰胺酶对杂环，芳香，饱和和不饱和的脂肪酰胺有亲和力，而另一方面，还有可诱导的酰胺酶对芳香酰胺有亲和力。甲酰胺是后者酰胺活性的最好诱导剂，这是在Kluyveromyces thermotolerans中腈和酰胺水解酶系统的首次报导。另外，产酸克雷伯式菌(Klebsiella oxytoca) 107也从含氰的废水中分离出来。该菌能用许多腈类作为唯一的氮源。琥珀腈（Succinitrile）和戊腈（valernitrile）是该菌株生长的最适的氮源。乙腈转化成乙酰胺然后变成乙酸。在生物降解试验中也检测到了氨。在生物转化实验中丙腈也有类似的结果。结果显示，这种微生物的转化乙腈和丙腈的分解包括两个步骤，酰胺作为中间产物而酸作为最终的产物。2007年108在一系列酸性富集培养基中使用不同的腈类作为唯一的氮源，分离到耐酸的腈水解微生物。在一个加有pH4的柠檬酸钠和磷酸盐的缓冲液的富集培养基中，以葡萄糖为碳源，以唯一苯乙腈为氮源，获得了一株黑酵母，随后的18SrRNA基因序列的鉴定为少籽外瓶霉exophiala oligosperma R1。为了细胞的生长和腈转化，优化了微生物的生长条件。静息细胞的实验证实，苯乙腈被转化要经过苯乙酸和2羧基苯乙酸步骤。在pH4时，有机体能够以苯乙腈作为唯一的碳源，氮源和能源。在无细胞提取物中也检测到了腈水解酶的活性。发现了腈水解酶活性的指示剂。无细胞提取物，加之，苯乙腈以及不同的苯乙腈的替代物。在pH在1.5-9的范围内，菌株对苯乙腈的转化率基本相同。人们对109Rhodococcus rhodochrous PA-34腈水合酶活性进行了探讨，通过烟腈转化成烟酰胺。腈水合酶的活性（18U/dcw）被观察，在0.1M磷酸缓冲液下，烟腈为底物，40，每毫升反应混合物中有静止细胞（细胞干重）0.75毫克。然而，在高底物（烟腈）浓度下，25更适合延长分批反应。在分批反应中（1L），25，12小时，使用9.0g静止细胞（干细胞重），7M烟腈（729g）完全转化成烟酰胺（855g）。同年发现来自于嗜热性假诺卡(氏)菌(Pseudonocardia thermophila )JCM 3095的腈水合酶109能催化腈水合成相应的酰胺。对脂肪腈要比芳香腈的活力高100倍。为了更好的理解这种选择性，进行了一系列的脂肪腈和芳香腈以及相应的酰胺与基于X射线结构模型蛋白的对接实验。在结合的模式中发现了实质性的差别。显示了对脂肪化合物更好的构象自由度。观察到存在于酶的活性位点处的转录后修饰的半胱氨酸有明显的相互作用。模型显示由金属离子激活的水分子可能更直接地去攻击对接的丙烯腈，使这种分子转化成丙烯酰胺。这种对接研究为本文中讨论的反应机制之一提供了支持。丁酰胺是重要的化学商业品，用于异羟肟酸合成和电流变液，以及制备阿莫多有机锌化合物。Rhodococuccus erythropolis-34 腈水合酶催化丁腈转化成丁酰胺101。在pH7.0,10%丁腈和1mg细胞干重（dcw）下，10，观察到Rhodococcus rhodochrous PA-34的腈水合酶活力为18/cdw。在85%丁腈存在下培养一小时，Rhodococuccus erythropolis-34细胞几乎保持有50%的活力。1升反应液，10，6小时培养，1g 细胞（cdw）,使用 60%(v/v)的丁腈，获得597g的丁酰胺（6.8M）。最近，腈水合酶基因工程研究进一步发展，来自Rhodococcus erythropolisAJ270编码对映选择性的腈水合酶（NHase）已经被克隆，有活性的腈水合酶在大肠杆菌中得到生产。当编码亚基和亚基的基因作为一个单元转录，并且与编码P44激活子蛋白作为单一复制子上分离的开放阅读框同时转录时，发现有最大的酶活性。增加丁酸和硫酸铁能提高酶活。在P44蛋白存在时，GroEL-GroES分子伴侣共表达时能增加酶的活力，而当不存在P44蛋白时则无效。在合成来源于手性底物3-甲酰氧戊腈的产物S-(+)-3-甲酰氧-4氰基丁酰胺的过程中，具有高度的对映体选择性。在分段加料培养中人们发现103，Rhodococcus rhodochrous PA-34菌株的诱导型细胞腈水合酶催化丙烯腈转化成丙烯酰胺，固定于2%（w/v）琼脂（1.76毫克细胞干重、毫升琼脂基质）在10，反应混合物包括0.1M磷酸钾缓冲液（pH7.5）,8%(w/v)的丙烯腈，酶毫升相当于1.12毫克细胞干重的固定化细胞的反应体系中，对丙烯腈形成丙烯酰胺的转化有最大的酶活性（8.25U/dcw）。10下，分段加料分批培养的反中，使用1.12g dcw 固定化细胞，终体积为一升，24小时内，整个372g的丙烯腈完全被水合成丙烯酰胺（498g）。从上面的反应混合物中，87%的丙烯酰胺在4结晶获得。通过固定化催化剂6次循环，共有2115g丙烯酰胺产生出来。重组酶的特性研究加快，人们研究了来自于Rhodococcus equi TG328-2菌株的腈水合酶（NHase,EC4.2.1.84）基因（亚基和亚基）和激活子基因被克隆和测序。铁型腈水合酶由209个氨基酸（亚基，分子量23kDs）和218个氨基酸（亚基，分子量为24KDs）以及413个氨基酸（分子量46kDs）组成。不同的启动子，腈水合酶，激活子基因的组合被构建，在大肠杆菌中产生有活力的重组酶。当腈水合酶激活子基因同腈水合酶基因分别在大肠杆菌BL21和大肠杆菌DE3共表达时，对甲基丙烯腈获得最大酶活力（844U/粗提细胞）。经法式压滤壶、组氨酸标签亲和层析，超过滤和冷冻干燥，得到61%的产率，并显示典型的铁型腈水合酶的特征：除了芳香和杂环腈外，优先水合脂肪腈。纯化的酶对甲基丙烯腈的比活力为6290U/mg。对芳香化合物的对映体选择性的E质仅仅在5-7范围内，酶显示了广泛的最适pH范围，从6到8.6。在30时酶活力最高。在温度为4-50范围内进行热失活研究中发现在4时候有最高的稳定性。随着腈水合酶的进一步研究和酶的作用机制进一步阐明，将为工业酶的开发利用奠定基础。3、课题拟解决的主要技术问题，在理论和应用方面的意义，完成课题的条件（包括个人业务水平、教研室或学科组的技术、设备条件）和拟采取的研究方法、技术路线及实验可行性分析：3.1主要技术问题此研究的基本目的是确定红球菌CGMC3090腈水合酶的分子结构，这种详细的结构信息将被用以帮助我们更深入地了解该酶的特性和酶的催化机理。为达到此目地需要解决如下技术问题：（1）纯化红球菌CGMC3090腈水合酶使其可以达到结晶的程度。（2）优化酶的结晶条件。（3）腈水合酶基因蔟的结构。（4）为进行X射线衍射分析制备腈水合酶的衍射级晶体。（5）阐明高分辨率的红球菌CGMC3090的晶体结构。（6）应用从晶体结构中获得的知识与底物分子对接初步阐明该腈水合酶的反应机理。3.2在理论和应用方面的意义：红球菌CGMC3090腈水合酶晶体结构的阐明不仅能更好地认识酶作用底物广泛的原因，解释酶作用的底物多样性和区域选择性的实质，更好地了解酶的特性，而且对寻找更多的底物起到重要的作用，从理论上解释该腈水合酶的反应机制。同时，也必将在工业酶的应用方面做出贡献。3.3完成课题的条件： 本人所在实验室有先进的技术和设备，包括高压液相色谱仪，高速低温离心机，真空干燥冷冻设备，纯水仪，蛋白质纯化仪器，对蛋白质的纯化（包括各种层析设备）没有问题。蛋白质的结晶液不成问题。而且有经验丰富的专家、导师和教授，这无疑为实验的成功奠定了坚实的基础。因此通过本人的努力以及和天津大学和南开大学的相关单位的合作，一定能成功完成实验。3.4拟采取的研究方法、技术路线研究方法：1、腈水合酶产生菌的培养、酶活性的测定和提取和纯化方法的优化（1）腈水合酶产生菌Rhodococcus rube.CGMCC3090的培养。采用优化的培养培养条件对Rhodococcus rube.CGMCC309菌株进行进行发酵培养，获得大量的菌体为腈水合酶的提取提供大量的材料。（2）腈水合酶提取和纯化条件的优化腈水合酶的提取和纯化。采用硫酸铵分级沉淀，透析除盐，真空冷冻浓缩酶蛋白质，通过优化各种层析 (包括阴离子交换柱，疏水柱层析，和凝胶过滤)方法和条件对腈水合酶蛋白质进行纯化。Native-PAGE和SDS-PAGE电泳检验纯化的酶蛋白的纯度。使酶蛋白达到电泳纯，进一步纯化使其达到能结晶的标准，为酶结晶提供优良的高纯度的蛋白质。2、腈水合酶酶活性的测定（1）对菌体酶活进行测定。以烟腈为底物，采用气相色谱或高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography HPLC) 测定菌体酶活力。按国际单位计算每克细胞干重的酶活力。（2）对腈水合酶酶活力的测定。按几个步骤得到的酶蛋白进行酶活力的检测。包括超声波破碎细胞、硫酸铵分级沉淀、透析上清、各种层析过柱得到的纯化酶蛋白进行测定。根据蛋白质标准曲线计算各步骤的酶的比活力和纯化倍数。3、腈水合酶的基因的克隆和相关序列的分析 （1）根据所纯化的腈水合酶的蛋白质可以测定该酶蛋白的N端氨基酸序列，然后在NVBI网站通过Blast 软件将该N端序列与其他网上已经公布的其他已知的腈水合酶的蛋白质N端序列进行比对，比较它们之间的同源性。 （2）通过网上查询已知的腈水合酶的基因的同源保守序列设计上、下游引物，通过聚合酶链式反应（PCR）方法，扩增出包括腈水合酶、亚基基因的的基因蔟，连接到克隆载体上进行核苷酸序列的测定。并于已知的腈水合酶基因进行比对，计算它们之间的核苷