5发酵过程控制5(补料).ppt

发酵工程课件FermentationEngineering 第五章发酵过程控制 5 主讲人 夏帆 欢迎 光临 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 2 教学目的 了解中间补料的原因 优缺点 掌握中间补料的意义 原则及控制 教学重点 难点 中间补料补什么 怎么补 补糖时间 补糖量 补料方式 1 补充能源和碳源2 补充氮源3 补前体4 补水 无机盐和微量元素 第五节中间补料及其控制 2学时 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 3 中后期营养不足 菌体过早衰老 初始培养基营养过于丰富造成菌浓过大而缺氧 初始培养基中葡萄糖过多引起抑制 代谢后碳氮源不平衡 微量元素缺乏 合成产物或中间产物积累的毒性 中间补料的原因 4 内容速览 二 中间补料控制 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 5 意义 控制菌的生长速率以及培养中期的代谢活动 延长合成期 推迟菌体自溶 另外 加入前体增加合成产物的中间体 从而使产量大幅度提高 原则 控制和引导产生菌在培养过程中 特别是中后期的生化代谢活动向着有利于产物积累的方向发展 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 6 补什么 怎么补 1 补充微生物所需的能源和碳源物质发酵过程中 能源是从主要碳源来的 碳源是菌体需要量最大的物质 在发酵前期消耗很快 到了产物合成阶段菌体要维持活性必须补充碳源 以便延长产物合成期 如添加葡萄糖 液化淀粉 饴糖 作为消泡剂的天然油脂 同时也起到补充碳源的作用 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 7 补碳源最早的例子谷氨酸 在原工艺 初糖浓度较高 的基础上 减少初糖 葡萄糖 浓度 增加生物素 作用是用于细胞合成 用量达5 g L 加大接种量到10 左右 以利于菌体迅速繁殖 获得生产所需要的足够量的菌体 当进入产酸期 残糖达2 左右 连续补糖 维持糖浓度在2 左右 提高温度到36 37 流加氨水或尿素 维持pH7 0 7 5 利用菌体所形成的酶系继续进行发酵 产酸可达10 后来补糖方法在抗生素发酵中普遍采用 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 8 补糖控制考虑 补糖时间 补糖量 补糖方式参考数据 糖耗速率 残糖浓度 pH变化 菌体浓度 菌丝形态 发酵液黏度 溶氧浓度等 一般选择其中两到三个参数来考虑 常用的两个参考指标 还原糖水平和总糖水平 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 9 根据还原糖水平 如赤霉素还原糖降到0 6 就需要补糖 根据总糖水平 如抗生素发酵 有的是2 或3 不等 具体要根据菌的酶系和pH变化的大小来决定补还原糖还是总糖 如 菌体淀粉酶活力高就可补淀粉之类的物质 总糖 若淀粉酶活力低那就补还原糖 补还原糖pH变化明显 而补淀粉 由于它是水解糖 pH变化很小较稳定 注意 不同的发酵阶段控制的残糖浓度有可能不同 如金霉素 前期3 5 中期2 5 后期1 5 常用的两个参考指标 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 10 补糖时间控制很重要 过早会刺激菌体生长 加速糖的消耗 不利于合成产物 过迟所需能量供应不上菌体已老化 合成产物的能力本身都很低了 例 四环素补糖时间96h效价20h6000u ml45h10000u ml62h6000u ml说明 开始补糖的时间必须根据代谢的变化情况来决定 即根据基础培养基的碳源种类及用量 菌丝生长情况 糖的消耗速率及残留水平来综合考虑 不能单纯以时间为依据 补糖时间 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 11 采用间歇补料分批发酵 补加时间以发酵液中还原糖水平为控制指标 实验条件 当葡萄糖浓度分别降至3 2 5 2 1 5 时开始平均每隔6h补糖一次 维持葡萄糖浓度分别在3 2 5 2 1 5 研究对纳他霉素产量的影响 发酵周期都为96h 结果如下表 例 根据残糖浓度补料发酵提高纳他霉素产量药物生物技术 何艳玲 2002 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 12 纳他霉素Natamycin Streptomycesnatalensis Streptomyceschatanoogensis Streptomycesgilvosporeus一种天然 广谱 高效安全的酵母菌及霉菌等丝状真菌抑制剂 它不仅能够抑制真菌 还能防止真菌毒素的产生 对人体无害 很难被人体消化道吸收 而且微生物很难对其产生抗性国际上唯一的抗真菌微生物防腐剂 97年卫生部正式批准纳他霉素作为食品防腐剂 目前该产品已经在50多个国家得到广泛使用 主要应用于乳制品 肉制品 发酵酒 饮料等食品的生产和保藏 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 13 补糖时间的选择 补糖时间过早 刺激菌体大量繁殖 加速糖的利用 进而影响抗生素产量的增加 补糖时间过迟 使菌体所需能量供应跟不上 当还原糖浓度降至2 时 发酵开始由菌体生长阶段向代谢产物合成阶段转变 此时补糖并维持糖浓度在2 可延长抗生素分泌期 并使纳他霉素以最大的生产速率不断合成 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 14 补糖量的控制 以控制菌体浓度不增或略增为原则 使产生菌的代谢活动有利于产物合成 一般在补糖开始阶段控制还原糖在较高水平 以利于产物合成 但高浓度的还原糖不宜维持过久 否则会导致菌体大量繁殖影响产物的合成 一般还原糖水平维持在0 8 1 5 之间较为合适 补糖量 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 15 例 不同补糖速率对L 缬氨酸发酵的影响初糖浓度为80g L 发酵30h后 分别以10g L h 25g L h 40g L h的补糖速度进行 结果如下 谷氨酸棒杆菌 天津科技大学 赵丽丽 2002 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 16 补料方式可分为 连续流加不连续流加 少量多次 大量少次 多周期流加连续流加效果最好 可以避免因一次大量加入引起环境突然改变给菌体代谢带来的影响 每次流加又可分为 快速流加 恒速流加 指数速率流加 变速流加 从补加营养物成分来看 又有单组分补料和多组分补料 补料方式 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 17 例 L 缬氨酸补料分批发酵的研究分别采用不同的补料方式来进行 一次定量加入 在发酵30h 残糖浓度为1 2 时 一次性补加467mL补料液 60 的葡萄糖水溶液 使总糖浓度达到15 间歇定量加入 在初糖浓度降为1 2 时 补加117mL补料液 然后每当残糖浓度降为1 2 时补加 分4次补完 总量为468mL 间歇恒速流加 每当残糖浓度降为1 2 时 就以25g L h的速度流加补料液 直至467mL补料液全部补完 南开大学学报 赵丽丽等 2002 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 18 不同补料方式对L 缬氨酸发酵的影响 不同补料方式 菌体浓度相差不大 但葡萄糖转化率相差较大 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 19 例 补料方式对酵母菌生产谷胱甘肽的影响工业微生物 童群义等 2003三种不同的流加补料模式 酵母菌 恒速流加补料分批培养 指数流加补料分批培养 恒pH补料分批培养模式 不同的流加方式也会有不同的结果 解毒辐射病及辐射防护保护肝脏抗过敏改善某些疾病的病程和症状养颜美容护肤增加视力及眼科疾病抗衰老作用 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 20 装液量3L 5L罐接种量5 空气流量1L L min用适量的酸 碱调节培养液的pH至6 5温度30 转速150r min培养12h后 流加40g L的葡萄糖溶液 至60h流加结束 72h培养结束 培养条件 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 21 在培养过程中以恒定的流速加入葡萄糖好处 解除了底物抑制 葡萄糖阻遏效应 结果延长了菌体的生长周期 增加了菌体浓度和GSH 谷胱甘肽 产量 结果见下图 恒速流加培养 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 22 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 23 理由 恒速流加 由于葡萄糖流加的速度始终恒定 在发酵的前期菌体浓度低 葡萄糖难以完全消耗 而到发酵后期 菌体浓度很高 但葡萄糖又不能满足菌体生长的需要 导致产物合成增加很少 指数流加方式可克服恒速流加的这一缺点 指数流加根据菌体的生长呈指数增加 它能够使反应器中营养物浓度控制在较低的水平 而使菌体浓度呈指数增加 结果见下图 指数流加补料方式 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 24 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 25 根据培养基pH的变化流加40g L的葡萄糖 由于葡萄糖的分解变成小分子酸使pH下降 当pH降低到一定程度后 加入碱液调节pH达到设定的数值 然后随着糖被消耗越来越少 pH又会升高 再根据糖的消耗加入适量的葡萄糖 当pH下降到一定程度后 又加入适量的碱液调节pH 如此反复 发酵液中始终保持在较低的葡萄糖浓度 至60h流加结束 72h发酵结束 恒pH补料分批培养模式 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 26 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 27 从图中可看出 采用恒pH补料分批培养既可以获得较高的菌体浓度 菌体中GSH含量也较高 达到了菌体合成和GSH生产的相对统一 因此 发酵液中的总GSH含量最高 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 28 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 29 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 30 酵母菌发酵的四种培养模式比较 分批培养由于没有进行补料 到发酵后期由于碳源不够 使得酵母菌的细胞干重和GSH总量都比较低 恒速流加方式改善了发酵后期的营养条件 使得细胞干重和GSH总量均有所增加 但由于在整个培养过程中采用恒定的补料速度 导致前期葡萄糖过量 而后期葡萄糖量又不足 因此 限制了细胞干重和GSH总量的增加 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 31 指数流加方式是基于微生物指数生长理论而发展起来的一种方法 在发酵的前期 微生物的数量较少 因而补料的数量也比较少 随着微生物数量的指数增加 补料也按指数方式增加 但发酵后期为酵母生成GSH的重要阶段 大量的补糖适合酵母菌的生长 而并不适合GSH的合成 恒pH补料分批培养则是根据发酵液pH的下降与升高来控制葡萄糖的补料 当调整至合适的pH时 可确保发酵液中的葡萄糖含量始终保持在较低的水平 因而可获得较高的GSH总产量 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 32 补氮是发酵控制的另一个重要项目 主要作用是调节pH和补充产生菌所需的氮源 从而控制代谢活动 生产上补氮有两种 补充有机氮源 补充无机氮源 通氨 补硫酸铵 2 补充微生物所需的氮源 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 33 添加某些具有调节生长代谢的有机氮源 如尿素 酵母粉 蛋白胨 玉米浆 保持菌的活性 补充产物合成所需的氮源 有时与碳源一起配合补料 工厂称作补混合料 1 补充有机氮源 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 34 例 土霉素发酵前期补2 3次酵母粉 放罐单位比对照高1500u ml 青霉素发酵47h开始加尿素 每6h补加一次 结合补加乳糖 发酵单位可达40000u ml以上 赤霉素生产补加的氮源是花生粉 配16 的花生粉液体 当菌生长到粘度大于15秒时 说明氮源被消耗很多 就开始补加花生粉 对于含氮产物的生产特别需要补氮 补料依据 氨基氮的消耗 菌的浓度 pH变化 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 35 在谷氨酸生产中 尿素作为氮源时首先被菌体的脲酶分解变成氨 使pH上升 前12h为菌体生长阶段 由于菌体生长快 氨被利用 使pH下降 这时要及时流加尿素 供给菌体生长所需的氮源并调节pH 生产阶段菌生长停止 尿素先被脲酶分解为氨 使pH上升 氨被利用来合成谷氨酸 使pH下降 再次流加尿素 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 36 A通氨某些抗生素提高产量的有效措施 它的作用是补充无机氮源和调节pH 通氨一般使用压缩氨气或氨水 20 采用少量间歇添加或自动流加 由空气管道流入与发酵液均匀混合 氨浓度控制通过测定氨的比消耗速率 菌的比生长速率 产物比合成速率和pH来控制补加速率 2 补无机氮源 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 37 例 林可霉素原来基础培养基中 NH4 2SO4为0 6 18h后减少到7mg 100ml 发酵后期缺少氮源 改进工艺 将基础培养基中 NH4 2SO4减少为0 5 14 6h开始补加30 NH4 2SO4溶液 根据培养液的pH和NH2 N浓度控制加量 正常情况下NH2 N保持在10mg 100ml以下 平均补加硫酸铵1 5 提高了发酵单位 B补硫酸铵 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 38 补氮控制 补氮时间 补氮量 补氮方式根据氮消耗速率 菌浓度 发酵液粘度 pH决定补料的时间和补料的量 补充黄豆饼粉 酵母粉一般采取分批补料 而无机氮源和尿素一般采取流加方式 因为这些氮源对pH的影响大 而且过多的氨离子会对菌的生长产生抑制作用 05 03 2020 长江大学生科院生物工程系 39 补入碳源还是氮源以及它们的量多少要根据产物的分子结构及细胞组成来决定 有的发酵氮源很低时也不需补氮源 是因为产物分子中几乎不含氮 当同时需要补充碳源和氮源时 可以混合起来一起加入 补料浓度的确定可以以摇瓶的基质残留浓度为依据进行试验 05 03 2020 长