贺敏硕士研究生开题报告.ppt

欢迎各位老师 同学 广西医科大学硕士研究生学位论文开题报告 课题名称 利福平对醋氨酚肝毒性的保护作用和机制研究生姓名 贺敏导师姓名 黄仁彬 研究内容 意义和预期结果 通过体外小鼠肝微粒体温孵法和高效液相色谱法等研究利福平对醋氨酚肝毒性的影响 观察醋氨酚 利福平 谷胱甘肽在不同条件下体外鼠微粒体温孵中含量的变化 以及新的代谢产物的产生 通过细胞培养 酶学等技术进一步探讨利福平的保护作用机制 国内外对利福平对醋氨酚肝毒性的影响的研究较少 本次实验主要从分子水平研究 进一步明确利福平对醋氨酚肝毒性的保护作用机制和机理 更好的了解利福平对醋氨酚肝毒性的保护作用 研究背景 1醋氨酚是常用的解热镇痛剂 其小剂量 短期服用 即使在有肝病的患者中 也无明显的毒副作用 而在大剂量或长期使用时 常可导致严重的毒性作用 2国内外已阐明小部分的醋氨酚由肝脏内细胞色素P450混合功能氧化酶代谢成N 乙酰 对苯醌亚胺 NAPQI NAPQI能迅速和谷胱甘肽结合成谷胱甘肽 NAPQI复合体生成硫醚氨酸最终由尿液和胆汁中排泄而解毒 或者通过谷胱甘肽依赖的还原反应而重新生成醋氨酚或N 羟基对乙酰氨基酚 在毒性剂量 一次服用50mg Kg 时 由于大量的NAPQI的产生 致使谷胱甘肽耗竭 大量的NAPQI与肝细胞的许多重要的生物大分子结合 导致肝细胞功能紊乱 研究背景 研究背景 3一些服用肝细胞色素P450诱导剂如苯巴比妥都能增加醋氨酚的毒性 一些肝细胞色素P450抑制剂如西米替丁及谷胱甘肽提供体如半胱氨酸能减轻醋氨酚的毒性效应 4广西医科大学黄仁彬教授在世界首次发现了肝细胞色素P450诱导剂利福平却能减轻醋氨酚的谷胱甘肽耗竭作用 研究目标与内容 通过体外小鼠肝微粒体温孵体外法和高效液相色谱法等研究利福平对醋氨酚肝毒性的影响 观察醋氨酚 利福平 谷胱甘肽在不同条件下体外鼠微粒体温孵中含量的变化 以及新的代谢产物的产生 通过细胞培养研究利福平对醋氨酚中毒引发的肝细胞损伤的保护作用 通过酶学客观反映利福平对肝内代谢酶如GST的影响 利福平对肝脏CYP2E1表达的作用的研究及对醋氨酚中毒引起的细胞DNA损伤的作用的研究 拟采用的研究方法 关键技术指标及解决途径 一体外实验小鼠肝微粒体制备 用冰冷的生理盐水从肝门静脉或动脉冲洗肝至陶土色 按重量体积比1 3加入冰冷的50mM的PBS 20 甘油溶液 冰浴匀浆 取肝匀浆分别用高速离心机9000g和超速离心机40000转 约100000g 差速离心 取粉红色沉淀用冰冷的50mM的PBS 甘油冰浴悬浮 用双缩脲法测定蛋白 稀释成2mg ml 80 保存 测定P450和b5含量按资料进行 拟采用的研究方法 关键技术指标及解决途径 体外小鼠肝微粒体温孵法 保持肝细胞色素P450的高含量和高活性 确保药物在孵育中能进行代谢 加入一定的催化剂进行催化 拟采用的研究方法 关键技术指标及解决途径 1首先建立醋氨酚 利福平和GSH及其相关代谢产物在酶系统中的HPLC检测方法 考察方法学 2先考察APAP和RFP在体外PBS中是否有相互作用 拟采用的研究方法 关键技术指标及解决途径 3建立和优化体外肝P450酶系统 指标是醋氨酚在这个酶系统中有代谢即醋氨酚母体的浓度下降 且在这个系统中GSH的浓度比对照组明显下降 表明有NAPQI的产生 NAPQI是无法检测到的 因为它一产生就和GSH或蛋白结合 只能通过GSH耗竭反映NAPQI的水平 拟采用的研究方法 关键技术指标及解决途径 4建立了酶系统和检测方法后 再加入利福平等物质在不同体系 不同的浓度 不同的时间观察三者及其代谢产物如的量的变化 另外还观察一些氧化产物如GSSG及醌式利福平的变化等 由它们量的变化关系总结规律 得出结论 拟采用的研究方法 关键技术指标及解决途径 5有能力有条件就找出利福平和NAPQI的结合产物 6重复实验数次 考察结果的准确性 7根据实验结果再进行下一步的探索 拟采用的研究方法 关键技术指标及解决途径 二 细胞培养1离体的小鼠肝细胞和1 0mM 10mM醋氨酚培养2h 观察肝细胞损伤程度 2另组加入不同剂量利福平和不同剂量醋氨酚培养2h 观查肝细胞损伤程度 观察利福平是否有预防肝细胞损伤作用 拟采用的研究方法 关键技术指标及解决途径 3观察利福平对已损伤的肝细胞损伤是否有恢复作用 将1 0mM醋氨酚培养1 5h冲洗移除非共价结合AA 重新悬浮在含利福平的培养基中 观察 对照可选择生理盐水 NAC N 乙酰半胱氨酸 2 0mM 和DTT 二硫苏糖醇 1 5mM DTT能减少细胞毒性 有条件可以用NAPQI做细胞培养 拟采用的研究方法 关键技术指标及解决途径 三 利福平对肝脏CYP2E1表达的作用的研究及对醋氨酚中毒引起的细胞DNA损伤的作用的研究CYP2E1是促使健康人形成NAPQI形成的主要酶 P450酶的其它异构酶对此作用微小 课题的创新点 在黄仁彬教授研究的基础上 从分子水平进一步深入阐明利福平对醋氨酚肝毒性的保护作用的机制 预期结果 利福平可能是通过竞争性的和NAPQI作用 从而达到提高GSH含量 减轻NAPQI对肝细胞的损伤 也有可能利福平对肝脏的某种酶有相关作用 研究基础 本实验室多年从事生化药理及毒理的研究 具备有实验所需的设备 黄