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四川农业大学本科生毕业论文（设计）开题报告毕业论文（设计）题目石海椒不定芽诱导和无菌苗培养培养基的选择选题类型应用型课题来源自选项目学 院农学院专 业农学指导教师古玉职 称讲师姓 名许强年 级2006级学 号200600831 立题依据 2008年7月，作者在四川农业大学读书公寓区发现一种开放着金黄色小花并伴有清香的野生花卉。经过长期观察，发现该植物既可地栽，也可盆栽，具有较大的观赏价值和园林绿化应用价值。经鉴定为石海椒Reinwardtia trigyna，别名金雀梅、黄亚麻、迎春柳、过山青、米汤糊，属亚麻科石海椒属植物，原产我国西南地区、越南、印度及印度尼西亚，适宜生长于阳光充足、通风良好、土壤肥沃且排水良好的环境。21世纪以来，人们物质文化生活水平不断提高，对观赏性花卉的要求也不断提高。传统的观赏性花卉已难以满足需求，寻找新的品种势在必行。从大量的资料和实践观察了解到，野生花卉石海椒具有很大的优势。第一，石海椒的灌丛树势自然圆整，树枝婆娑，叶片四季常青、花数众多、花色金黄、花形典雅、香气淡雅、花期较长，观赏性极高。第二，石海椒喜阳耐荫，即耐热也较耐寒、耐旱，抗逆性强，适应性广泛。第三，石海椒的病虫害较少，只需依季节和天气的变化，对其进行必要的肥水管理即可正常生长和开花结果9。但石海椒属于野生花卉，引种和直接移栽都存在各种限制。要更好的推广该花卉，首先要能大量的繁殖生产，对其进行组织培养可解决此问题。目前，国内对该植物研究报道极少，大多数文献1- 8 仅报道其生长分布状态和药用价值，未见对其的组织培养。为此，本文采用不同的组织培养条件，以石海椒的不同部位为外植体进行离体培养，选出合适的培养基以期培育出品质良好的完整植株，为该花卉的大面积推广应用打下基础。2 文献综述2.1 石海椒的形态特征 石海椒为常绿半灌木，植株高度为50-120cm左右，茎呈直立状态，圆柱形，无毛。1年生的枝条呈青绿色，2年生以上的茎呈灰色至灰褐色，分枝较多。叶片互生，叶形为椭圆形或倒卵状椭圆形，长度为2.5-7.0cm，顶端圆或锐尖，基部呈楔形，叶缘全缘或具细锯齿，叶柄短，托叶刚毛状，早落。花单生或数朵簇生于叶腋或枝顶，上部枝条每个叶腋都能着生花朵，在2年生枝条上每个叶腋着生1-2朵花，多数叶腋又同时长出分枝，每条分枝先开花后长出叶片，每个节上都能开1朵花。在石海椒开花过程中，通常情况下是枝条边开花边伸长，边伸长又边开花，连续不断，直至开花结束。同时，在植株下部老的枝条上着生的当年生新梢上也能开几朵花。据初步统计，一株单株每年可以开放百余朵花，每朵花可以开放23天，一丛植株前后开花时间可以达到25-35天。花冠呈漏斗状或喇叭状，直径2.2-2.8cm；萼片5，宿存；花瓣5，黄色或金黄色；雄蕊l0枚，5枚退化，花丝下部合生；子房3室，花柱3 10。2.2 石海椒的研究现状自20世纪80年代以来，我国对石海椒的开发利用不论在程度上，还是在广度上都有较大发展。初步对其观赏价值和药用价值进行了研究，但研究水平还处在起步阶段，推广范围和幅度都还不够。到目前为止，关于石海椒的光温特性、水分控制、生长发育规律，规模化生产技术、施肥方法和技术等方面的报道极少，国内的试验研究几乎处于空白状态，这些问题的存在，都较大程度限制了石海椒的应用，有待进一步深入地探讨。2.3 我国组织培养应用现状植物组织培养是以植物细胞的全能性为理论基础，从20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术。它是指在无菌条件下，将离体的植物器官(如根、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等)、组织(如形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(如体细胞、生殖细胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生质体(如脱壁后仍具有生活力的原生质体)培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽等，进而培育成完整的植株，统称为植物组织培养。由于是在试管内培养，而且培养的是脱离植株母体的培养物，因此也称之为离体培养或试管培养。根据外植体来源和培养对象的不同，又分为植株培养、胚胎培养、器官培养、组织培养、原生质体培养等11。2.3.1 在植物育种上的应用 单倍体育种：单倍体植株往往不能结实，在培养中用秋水仙素处理，可使染色体加倍而成为纯合二倍体植株，这种培养技术在育种上的应用称为单倍体育种。单倍体育种具有高速、高效率、基因型一次纯合等优点，因此，通过花药或花粉培养的单倍体育种已经作为一种崭新的育种手段，并已开始育成大面积种植的作物新品种。1964年印度的植物胚胎学家Guha和Maheshwari将毛叶曼陀罗(Datura inoxia)的花药培养在适当的培养基上，使花粉转变成了胚状体，并从胚状体培养出了单倍体植株12。这一发现引起了植物学及遗传育种工作者的广泛重视，随后进行了大量的研究。近40年来，已通过花药(或花粉)培养技术诱导出被子植物，包括一些杂种的单倍体，共计247种，它们分别属于88个属，34个科。这一时期在药用植物的花药培养方面也做了很多的工作，已成功地从地黄(Rehmannia glutinosa)、乌头(Aconitum carmichaeli)、薏苡(Coix lacryma)、宁夏枸杞(Lyclum berbaum)、人参(P.ginseng)、平贝母(Fritillaria ussuriensis)、柑橘(Citrus reticulate Blanco)等药用植物的花粉中成功诱导出了完整植株13。 胚胎培养：在植物种间杂交或远缘杂交中，杂交不孕给远缘杂交带来了许多困难。而采用胚的早期离体培养可以使胚正常发育，并成功地培养出杂交后代，再通过无性系繁殖获得数量较多、性状一致的群体。胚培养已在50多个科属中获得成功。远缘杂交中，可将未受精的胚珠分离出来，在试管内用异种花粉在胚珠上萌发受精，产生的杂种胚在试管中发育成完整植株，此法称为“试管受精”。用胚乳培养可以获得三倍体植株，为诱导形成三倍体植物开辟了一条新途径。三倍体加倍后能得到六倍体，可育成多倍体新品种。细胞融合：通过原生质体融合，可部分克服有性杂交不亲和性而获得体细胞杂种，从而创造出新种群或育成优良品种，这是组织培养应用最诱人的一个方面，已获得40余个种间、属间、甚至科间的体细胞杂种、愈伤组织，有些还进而分化成苗。目前，采用原生质体融合技术已经能将不易杂交的植物(如番茄与马铃薯、烟草与龙葵、芥菜与油菜等)原生质体融合后获得属间杂种。随着原生质体融合、选择、培养技术的不断成熟和发展，今后可望获得更多有应用价值的经济作物体细胞杂种及新品种。基因工程：用基因工程的方法，把目标基因切割下来并通过载体使外来基因整合进植物的基因组是完全有可能的，这项研究如果获得成功，将克服作物育种中的盲目性，而变成按人们的需要操纵作物的遗传变异，育成优良品种。目前这项研究成为最热门的领域，但植物的遗传背景比原核生物更为复杂，因此，要用基因工程实现作物改良以增加产量和改善品质，这是21世纪生物技术领域要解决的一个重大科学问题。培养细胞突变体：无论是愈伤组织培养还是细胞培养，培养细胞均处在不断分生状态，容易受培养条件和外界环境(如射线、化学物质等)的影响而产生诱变，从中可以筛选出对人们有用的突变体，从而育成新品种。例如，对植物抗病虫性、抗寒性、耐盐性、抗除草剂毒性、生理生化变异株等的诱发为新品种筛选和选育提供了丰富的变异材料。目前，这种方法已筛选出抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白、矮秆高产的植物突变体，有些已应用于生产14。2.3.2 在植物脱毒上的应用果树、花卉、蔬菜等植物病毒病不下500多种，由于病毒通过无性繁殖传递，在母体内逐代积累，种性退化严重，表现为作物生长受到抑制，形态畸变，产量下降，品质变劣，严重时只好拔除病株，因而造成很大经济损失，而目前生产上对病毒病的防治尚无特效药物。通过植物组培脱毒技术来生产脱毒苗却可以实现防治目的，因此植物组培脱毒技术显得非常重要。植物组培脱毒技术有茎尖培养脱毒、花药培养脱毒、愈伤组织脱毒、珠心胚培养脱毒、茎尖微体嫁接脱毒等，其中由于茎尖培养脱毒效果好，后代遗传性稳定，是目前植物无病毒苗培育应用最广泛、最重要的一个途径。茎尖培养之所以能够除去病毒是因为病毒在植物体内的分布是不匀衡的。1943年怀特(White)发现受烟草花叶病毒( TMV) 侵染的番茄根尖不同部位，病毒的浓度不同，离尖端越远病毒浓度越高15。利马塞特(Limasset)等在1949年进一步研究发现，由病毒感染的植株，不同部位病毒分布不一致。在老叶和成熟的组织及其器官中病毒含量较高；而幼嫩的及未成熟的组织和器官中病毒含量较低，在生长点约0.11.0mm 区域，则几乎不含或含病毒很少16。莫勒尔(Mode)等(1952)根据病毒在寄主植物体内分布不均匀的特点，建立了茎尖培养脱毒方法17。目前，通过组织培养实现商业化的脱毒试管苗，在果树、蔬菜、花卉领域已十分普遍，如马铃薯、甘薯、大蒜、香蕉、柑桔、苹果、葡萄、百合、草莓、矮牵牛、康乃馨、月季、菊花、牡丹、花叶芋、山茶、甘蔗、草莓等已在中国广泛应用。经脱毒处理的作物产量都可以成倍增加。据报道，大蒜经组培脱毒后，蒜头可增产23.3114.3，蒜薹增产58.3175.0；用脱毒草莓苗进行生产，可提高果实产量20.745.5，果实可溶性固形物含量增加5.315.3。广东、福建等地的柑桔无病毒苗的培育获得成功，并大面积应用，福建省宁德县每年还将10万多的脱毒柑桔种苗出口到国外，取得了很好的经济效益18。2.3.3 在植物种质资源保存和交换上的应用农业生产是在现有种质资源的基础上进行的，由于自然灾害和生物之间的竞争以及人类活动对大自然的影响，已有相当数量的植物物种在地球上消失或正在消失。具有独特遗传性状生物物种的绝迹是一种不可挽回的损失。利用植物组织和细胞法低温保存种质，可大大节约人力、物力和土地，还可挽救濒危物种。同时，离体保存的材料不受各种病虫害侵染、不受季节限制，利于种质资源的地区间及国际问的交换和转移，给保存和抢救有用基因带来了希望。例如胡萝b和烟草等植物的细胞悬浮物，在20196的低温下贮藏数月，尚能恢复生长并且再生成植株19。目前，我国在多个地方建立了植物种质资源离体保存设施。2.3.4 在植物有用次生代谢产物生产上的应用利用植物组织或细胞的大规模培养，有可能生产出人类所需要的一切天然有机化合物，如蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱及其他化合物。因此，近年来这一领域已引起人们的极大兴趣，许多产业部门纷纷投资进行研究。目前，大约已有20多种植物的培养组织中有效物质高于原植物，国际上已获得这方面专利100多项。用单细胞培养生产蛋白质，将给饲料和食品工业提供广阔的原料生产前途；用组织培养方法生产微生物以及人工不能合成的药物或有效成分的研究正在不断深人，如中国科学院植物研究所的紫草细胞大规模培养、华中理工大学的红豆杉细胞大规模培养、上海中医药大学的黄芪毛状根大规模培养等20，有些已进行产业化生产，预计今后将有更大发展。2.4 国内外技术现状从20世纪50年代我国植物组织培养创始人之一罗士韦教授在中国科学院上海植物生理研究所开展了组织培养的研究以来，植物组织培养技术已有丰硕的研究成果。在近10多年来其发展更为迅速，全国各地许多农业科研院所和高校都开展了植物组织培养研究工作，对农作物、观赏植物、园艺作物、经济林木等上千种植物进行组织培养研究并取得了成功，同时在实践中总结出很多有益的经验，如郑文静等较好地总结了植物组织培养中的常见问题和具体解决方法21；吴毅明等在植物组织培养的环境微生态的研究中，用通透性好的化学纤维、纸卷、蛭石、沙子等代替琼脂作培养基，可有效地改善根际环境，促进小植物生根22；刘思九采用的暴露培养法，即在敞口培养器中用特制的粉沫状灭菌材料覆盖培养基和外殖体，使其不受污染，通过特制装置补水，让组培苗暴露在室内空气中生长，其长势优良，不炼苗即可移栽23。肖玉兰等研究的无糖箱式培养法(培养基不放糖，在培养瓶内用特殊装置注入CO2 ，然后加强光照3-5倍，小植物能进行光合作用自给养分)，使植株生长量成倍增长，有效地降低了生产成本24。3 研究内容3.1 石海椒的生物学特性观察3.2 石海椒不定芽诱导培养基的选择3.3 石海椒无菌苗增殖培养条件的选择3.4 计算石海椒不同部位进行组织培养的生根率4 预期目标通过对石海椒的组织培养研究，选出最佳的不定芽诱导培养基和成苗、生根培养基，应用到生产实践上。5 研究方案5.1 实验材料外植体为石海椒的幼嫩叶片和刚萌动的幼芽。5.2 培养条件不定芽诱导培养基：(1)MS+2，4D0.5 mgL-1+IBA 02 mgL-1；(2)MS+2,4D 10 mgL-1+IBA 02 mgL-1。(3)B5+2，4D0.5 mgL-1+IBA 02 mgL-1；(4)B5+2,4D 10 mgL-1+IBA 02 mgL-1。无菌苗增殖培养基：(5)MS+6BA 01 mgL-1+IBA 005 mgL-1；(6)MS+6BA 02 mgL-1+IBA 005 mgL-1。生根培养基：(7)1/2MS+IBA 005 mgL-1；(8)1/2MS+IBA01 mgL-1。以上培养基均含蔗糖30 gL-1 和琼脂粉58gL-1，pH 68。培养温度(22+2) ，光照强度2000lx左右，光照时间12hd-1。5.3 无菌材料获得从野外采回外植体在流水下冲洗，用细毛刷除去皮层的泥土及附着杂物。在超净台上将外植体置于无菌培养皿中，先用75的酒精溶液浸泡30s，然后用无菌水冲洗3次，再用0.1HgCl2灭菌6min，并不断搅拌，无菌水冲洗5次。5.4 不同部位外植体的诱导效果将外植体分别接种在愈伤组织诱导培养基上，观察不同部位外植体的诱导效果。5.5 愈伤组织的获得将外植体分别接种在含有不同浓度2,4D的MS培养基和B5培养基上培养。统计其愈伤组织诱导个数和愈伤率。愈伤率（）=长出愈伤个数接种外植体数1005.6 芽增殖的诱导将幼芽和培养的愈伤组织接种在含不同浓度的IBA和6-BA的培养基上观察其芽的增殖情况。计算出芽率。出芽率（）=出芽外植体数接种幼芽或愈伤组织数1005.7 对已发芽外植体的生根诱导将已发芽的外植体接种在不同浓度6-BA的1/2MS培养基中，观察其生根情况。计算生根率。生根率（）=生根外植体数接种外植体数1005.8 论文进度安排时间进度2008年9月-2009年5月查阅文献资料，撰写开题报告2009年5月-2009年6月实验材料药品的前期准备2009年6月-2009年7月完成石海椒外植体愈伤组织的培养2009年7月-2009年8月石海椒幼苗的培养基培养2009年8月-2009年11月试验数据处理，撰写毕业论文参考文献1严世珍羊城春花新秀石海椒J植物杂志，1995(5):20.2陈学似福建安溪鸟龙茶茶景园规划设计J规划师，2000(5):31.3吴端正华南地区冬季开花植物及其园林应用J亚热带科学，2006(4):55.4虞泽荪，黎云祥，郭延蜀，等二滩电站库区植被现状J四川师范学院学报(自然科学版)，1998(1):31-32.5苏雪痕，宋希强，苏晓黎城镇园林植物规划方法及其应用(3)热带、亚热带植物规划J中国园林，2005(4):63.6廖昕荣，熊源新格凸河景区种子植物区系的初步研究J山地农业生物学报，2005(1):61.7徐军贵州喀斯特峰丛洼地植被演替过程中种的生态位分析J贵州林业科技，2000(4):912.8朱华，赵见明，蔡敏，等云南德宏州种子植物区系研究(I)科和属的地理成分分析J广西植物，2004(5):198.9 赵君,刘金泉, 野生花卉的应用J.内蒙古农业大学学报，2007(9):28.10 彭世逞, 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