8转化BL21_2012年分子生物学实验.ppt

大肠杆菌BL21感受态细胞制备及重组DNA的转化 实验八 受体菌 一般不带特异的筛选标记 E ColiBL21 DE3 用T7启动子进行原核表达 DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7RNA聚合酶基因和lacI基因的 噬菌体 其基因型为 lacIlacUV5 T7gene1ind1sam7nin5重组质粒 Kanr pET28a eGFP 8 1 2受体菌与重组质粒 8 1 3质粒DNA的转化 Ca2 能与加入的DNA分子结合 形成抗DNA酶 DNase 的羟基 磷酸钙复合物 并黏附在细菌细胞膜的外表面上 当42 热刺激短暂处理细菌细胞时 细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动 并随之出现许多间隙 为DNA分子提供了进入细胞的通道 8 1 4影响转化效率的因素 细菌的生长状态 大肠杆菌在对数中期易产生感受态OD值 0 3 0 5 5X107个 ml 试剂的质量 化合物及无机离子 Rb Mn 二甲亚砜等质粒 大小 构型外源DNA 质粒 与细胞的比例 器皿的洁净度污染 尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进行 1 接单菌落到5mlLB液体培养基中 37 190rpm振荡培养过夜 2 1 50 l 菌液接种到含5mlLB的试管中 37 振荡培养1 2小时 至OD6000 4 0 5 已完成 3 将1 5mL菌液转移到离心管中 4 离心5000rpm 4 3min 5 倒出培养液上清 6 用冰预冷的1ml0 1M的CaCl2处理 轻轻悬浮细胞 7 冰上静置20min 8 5000rpm 4 离心5min 倒出上清 9 100 lCaCl2轻轻悬浮 冰浴待用 8 2 3大肠杆菌BL21感受态的制备 8 2 4质粒的转化 100 l的感受态细胞分成2管 50 l EP管 实验样品 将2 l重组质粒DNA加入到50 l感受态细胞EP管中 用枪头轻轻混匀 勿吹打 标记P 阴性对照 将2 l无菌水加入到50 l感受态细胞EP管中 用枪头轻轻混匀 勿吹打 标记P 冰浴10min 热击 42 90sec 静置 勿摇动迅速放到冰上 冰浴2min 复苏 加入950 lLB液体培养基 无抗性 标明组号 37 150rpm摇床培养15min 每两人一组做重组DNA的转化 每50 L感受态细胞悬液中加入2 L重组DNA 轻轻摇匀 同时设置一组对照 具体操作按下表进行 每组 两人 在转化菌复苏时制备三块KanLB琼脂平板 一块无抗性平板 并作好标记 制备LB琼脂平板 每组自己制备 含Kan的LB固体培养基倒平板三块 无抗性的LB固体培养基倒平板一块 涂布首先在平板底部标记好对应的组号和样品编号 样品名称及日期 阴性对照 编号3 涂200ul于无抗性平板 实验样品 编号1 2和4 涂200ul于Kan平板 培养静置15mins 倒置平板37 培养过夜 第二天上午观察实验结果 并将平板放到4 保存 下周实验前 提前一天来接菌 8 2 5涂布棒的使用 1 使用前 浸入75 酒精中 2 在酒精灯上引燃涂布棒上的酒精 不要烧到手 3 等酒精烧完后 让涂布棒在空气中冷却 4 涂布均匀 5 将