药品微生物限度检测方法验证报告（二）.docx

药品微生物限度检测方法验证报告阿莫*微生物限度检测方法验证报告摘要 通过此次验证证明薄膜过滤法可用于含抑菌成分的阿莫*微生物限度菌数的检验，提高抗菌药物的检出率和回收率。阿莫*微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检测方法，包括染菌量及控制菌的检查。微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单相流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。此方法能有效消除阿莫*的抑菌性，同时不会影响阿莫*中可能存在的微生物生长，采用此方法可以使阿莫*中的微生物检出，从而确保了检验结果的准确性、可靠性及检验方法的完整性。关键词：阿莫*，验证，菌种，供试品。前言 随着人们质量意识的提高，人们对阿莫*质量检验指标中微生物限度的要求也越来越高，由于抗生素类药物的活性成分直接影响微生物在培养基中正常生长，选择正确的检测方法，提高抗菌药物的检出率是解决问题的关键，通过对阿莫*微生物限度检测方法-薄膜过滤法的验证，可以证明所采用的方法能有效消除阿莫*的抑菌性，同时不会影响阿莫*中可能存在的微生物生长，采用此方法可以使阿莫*中的微生物得以检出，确保检验结果的准确性、可靠性及检验方法的完整性。概述 在药品的微生物学检验中，为保证检验质量，对所用的检验方法必须经过验证，才能确保检验结果的准确可靠。因阿莫*有抗菌性，在进行微生物检测前，需对样品进行适当的预处理以消除样品本身对微生物检测所带来的干扰。验证内容1设备及材料1.1仪器设备：超净工作台、真空泵、无菌薄膜过滤器、托盘天平、生化培养箱。1.2试验材料：0.45um的无菌滤膜、刻度吸管、镊子、三角瓶、吸耳球、冲洗液（或稀释液，PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液），*.*%氯化钠溶液，靛基质试液，培养基（营养琼脂培养基、玫瑰红钠培养基）。1.3其它工具：*%酒精脱脂棉花、无菌衣、口罩、白大褂、拖鞋、无菌手套。2菌种菌种名称菌种编号到货日期接收人复核者 大肠埃希菌1012012010年11月25日李晓艳王海东黄色葡萄球菌1012012010年11月25日李晓艳王海东枯草芽孢杆菌1012012010年11月25日李晓艳王海东白色念珠菌1012012010年11月25日李晓艳王海东藤黄微球菌1012012010年11月25日李晓艳王海东3培养基营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、BL增菌培养基、肉汤培养基均由北京天坛生物制品股份有限公司提供；真菌液体培养基由北京双旋微生物培养基制品厂提供；蛋白胨由北京奥博星生物技术有限责任公司提供；氯化钠（分析纯）由天井市科盟化工工贸有限公司提供。名称批号配制日期配制人复核人营养琼脂培养基1009062010年12月5日魏鹏飞李晓艳玫瑰红钠琼脂培养基1009042010年12月5日魏鹏飞李晓艳4 供试品（阿莫*为石药集团中润制药（*）有限公司产品。）、稀释剂、冲洗液（具体的配制方法见附录1）供试品：阿莫*原料药3批，50g/批 批号：1012001、1012002、1012003稀释剂：*.*%氯化钠溶液 批号：101201冲洗液：pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 批号：1012015 实验前准备工作5.1玻璃仪器，以及各种仪器设备的校验：名称编号数量偏差标准检定期类别检定单位结论量筒100133910.52010年06月04日C类*自治区计量测试院合格吸量管（10ml）10011001-100111001000.52010年06月04日C类*自治区计量测试院合格吸量管（ml）10011101- 10011180800.52010年06月04日C类*自治区计量测试院合格标准以上温度计均应符合相应的偏差标准结论均合格备注C类，使用前一次性检定。6方法及步骤6.1 培养基制备：a营养琼脂培养基成份:蛋白胨10g；牛肉浸粉5g；氯化钠5g；琼脂14 g；纯化水1000ml。配制过程：称取营养琼脂培养基加入1000ml纯化水中，加热溶解，加入*%NaOH，调节pH使其为弱碱性，分装。容器名称及规格：500ml三角瓶，分装量400ml/瓶（或1000ml三角瓶，分装量700ml/瓶）。灭菌过程：灭菌要求121,30min。升温升压20min，上压后开始记时，保持121,30min，灭菌结束后待压力表回零后即可打开柜门。培养基检验：灭菌后pH值为7.20.1。用处：营养琼脂培养基可做菌落检查、细菌计数等。b玫瑰红钠琼脂培养基成份：蛋白胨5g；葡萄糖10g；硫酸镁0.5g；琼脂1520g；玫瑰红纳0.0133g；磷酸二氢钾1g；纯化水1000ml。配制过程：称取玫瑰红钠琼脂培养基，加入1000ml纯化水，加热溶解，使其全部溶解摇匀，分装。容器名称：500ml三角瓶，分装量400ml/瓶（或1000ml三角瓶，分装量700ml/瓶）。灭菌过程：灭菌要求121,30min。升温升压20min，上压后开始记时，保持121,30min，灭菌结束后待压力表回零后即可打开柜门。用途：玫瑰红钠琼脂培养基可用于霉菌、酵母菌计数。c*.*%葡萄糖肉汤培养基成份:胰酪胨10g；氯化钠5g；葡萄糖5g；牛肉浸粉3g；纯化水1000ml；配制过程称*.*%葡萄糖肉汤培养基加入1000ml纯化水中，微温溶解，加*%NaOH，调节pH为弱碱性，分装。容器名称及规格：试管，规格：30200mm，分装量40ml/支。灭菌过程：灭菌要求121，30min。升温升压20min，上压后开始记时，保持121,30min，灭菌结束后待压力表回零后即可打开柜门。培养基检验：灭菌后pH值为7.20.2。用途：肉汤培养基可用于传代菌种，制备菌悬液。d胆盐乳糖培养基（BL）成份：胨20g；乳糖5g；氯化钠5g；磷酸氢二钾4g；磷酸二氢钾1.3g；牛胆盐（或去氧胆酸钠）2g（0.5g）；纯化水1000ml。配制过程称取胆盐乳糖培养基，加入1000ml蒸馏水，加热溶解，使其全部溶解摇匀，加入*%NaOH，调pH为弱碱性，分装。容器名称规格：150ml三角瓶，分装量100ml。灭菌过程：灭菌要求121,30min。升温升压20min,上压后开始记时，保持121,30min，灭菌结束后待压力表回零后即可打开柜门。培养基检验：灭菌后pH值为7.40.2。用途：胆盐乳糖培养基可用于检验大肠杆菌。e 4-甲基伞形酮葡苷酸培养基（MUG）成份：胨10g；磷酸二氢钾0.9 g；硫酸铵2g；磷酸氢二钠 （无水） 6.2 g；硫酸锰0.5g；酸钠40 m；g硫酸锌0.5g；去氧胆酸钠 1 g；硫酸镁 0.1g；MUG 75 mg；氯化钠10g；纯化水1000 ml；氯化钙50mg。配制过程称取MUG培养基，加入1000ml纯化水，加热溶解，使其全部溶解摇匀，加入*%NaOH，调pH为弱碱性，分装。容器名称及规格：20200mm试管，分装量：5ml/支。灭菌过程：灭菌要求121，30min。升温升压10-15min，上压后开始记时，保持121,30min，灭菌结束后待压力表回零后即可打开柜门。培养基检验：灭菌后pH值为7.30.1。用途：MUG培养基可用于检验大肠埃希菌。f菌种斜面培养基成份：蛋白胨10g；氯化钠3.5g；酵母膏1.5g；牛肉膏1.5g；磷酸氢二钾3.68g；磷酸二氢钾1.32g；葡萄糖1g；琼脂20g；纯化水1000ml。配制过程称取菌种斜面培养基，加入1000ml蒸馏水，加热溶解，使其全部溶解摇匀，加入*%NaOH，调pH为弱碱性，分装。容器名称及规格：20230mm试管，分装量：35ml/支。灭菌过程：灭菌要求121，30min。升温升压10-15min，上压后开始记时，保持121,30min，灭菌结束后待压力表回零后即可打开柜门。培养基检验：灭菌后pH值为7.20.1。用途：菌种斜面培养基可用于检验大肠埃希菌。6.2供试品溶液的制备称取阿莫*供试品10g加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml,制成1：10均匀的混悬液，再取此混悬液10 ml加入90mlpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，制成1：102均匀的混悬液，最后取此混悬液10 ml加入90mlpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，制成1：103阿莫*供试品溶液100ml，然后按照此方法，共制备20瓶（各100ml）1：103均匀的阿莫*供试品溶液备用。6.3设备以及环境要求a各种物品都必须经高压灭菌柜消毒灭菌（高压灭菌柜的灭菌效果已验证）（具体步骤见附录3）b环境要求：环境洁净度：10000级，a.尘埃粒子数b.沉降菌数检验要求环境：超净工作台(100级) a.尘埃粒子数b.沉降菌数。6.4操作步骤a试验组：取上述1：103供试品溶液2瓶各100ml，分别经装有直径50mm、孔径0.45um滤膜（做平行样）的薄膜过滤器过滤后，用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液各冲洗滤膜3次，每次冲洗量为100ml，并在最后一次冲洗液中分别加入50-100cfu大肠埃希菌。取出2个滤膜，滤膜菌面向上贴于营养琼脂培养基平板上放置30-35恒温室48小时后计数。重复以上操作3次，但在最后一次冲洗液中分别加入50-100cfu其余3个菌，最后取出滤膜，滤膜菌面向上贴于相应的琼脂平板上按规定的温度和时间进行培养(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌贴于营养琼脂培养基放置30-35恒温室48小时后计数，白色念珠菌贴于玫瑰红钠琼脂培养基放置23-28恒温室72小时后计数。b稀释液对照组：不加供试品溶液，用等量pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试品溶液，操作同试验组。c菌液组：取上述金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌含50-100cfu/ml菌悬液各1ml至平皿中，每种微生物各接种3个平皿，再分别向接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的平皿内倒入营养琼脂培养基，向接种白色念珠菌的平皿内倒入玫瑰红钠琼脂培养基，倒入事先已冷却至45的培养基，每只平皿的培养基用量约10ml，轻轻转动平皿使培养基与试验菌混合均匀，凝固后按规定的温度和时间进行培养计数（金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌放置30-35恒温室48小时后计数，白色念珠菌放置23-28恒温室72小时后计数）。d供试品对照组：取上述1：103供试品溶液2瓶各100ml，分别经装有直径50mm、孔径0.45um滤膜（做平行样）的薄膜过滤器过滤后，用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液各冲洗滤膜3次，每次冲洗量为100ml。取出2个滤膜，滤膜菌面向上贴于营养琼脂培养基平板上放置30-35恒温室48小时后计数。重复以上操作，取出滤膜，滤膜菌面向上贴于玫瑰红钠琼脂培养基平板放置23-28恒温室72小时后计数)。e以上试验组、稀释液对照组、供试品对照组均做2个平行样。f重复上述操作，直至做完3批样品。7验证结果：7.1验证用微生物的稀释度和接种量菌种名称稀释度接种量(ml)大肠埃希菌CMCC(B)4410210-71金黄色葡萄球菌CMCC(B)2600310-71枯草芽孢杆菌CMCC(B)6350110-71白色念珠菌CMCC(F)1023110-717.2菌液组计数结果菌种名称计数结果平均值大肠埃希菌CMCC(B)4410270809080金黄色葡萄球菌CMCC(B)2600375838581枯草芽孢杆菌CMCC(B)6350177808079白色念珠菌CMCC(F)10231848382837.3供试品对照组计数结果培养基名称阿莫*批号计数结果平均值营养琼脂培养基101200186710120027561012003000玫瑰红钠琼脂培养基1012001423101200211110120030007.4试验组、稀释液对照组的最终结果 项目数据菌种阿莫*批号菌落计数稀释液对照组的菌回收率试验组的菌回收率试验组稀释液对照组大肠埃希菌101200180707264*%*%平均：75平均：68101200285717866*%*%平均：78平均：72101200365676567*.*%*.*%平均：66平均：66金黄色葡萄球菌101200168766860*.*%*.*%平均：72平均64：101200270806374*.*%*.*%平均:75平均：68101200368666666*.*%*.*%平均：67平均：66枯草芽孢杆菌101200170766269*.*%*.*%平均：73平均：65101200268706165*.*%*.*%平均：69平均：63101200366666665*.*%*.*%平均：66平均：65白色念珠菌101200180857682*.*%*.*%平均：82平均：79101200280807980*.*%*.*%平均：80平均：79101200379787877*.*%*.*%平均：78平均：77试验组的菌回收率=(试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数)/菌液组的平均菌落数*%。 稀释液对照组的菌回收率=稀释液对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数*%。8结果判断 在3次平行试验中，稀释液对照组的菌回收率应均不低于*%，若试验组的菌回收率均不低于*%，则按照该供试品溶液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数。验证总结从表一表四试验结果，得出贴膜法能有效检出阿莫*中微生物,其检出率是：细菌*%，真菌*%；试验组的菌回收率和稀释液对照组的菌回收率平均在*%以上, 该法是经薄膜过滤后，将其抑菌成分全部去除，直接贴于培养基上，吸附在膜上的细菌透过膜的孔隙从培养基上汲