5,cdk5与缺血性损伤.doc

Cdk5与大鼠脑缺血再灌注损伤时细胞凋亡的关系摘要：目的利用大鼠可逆性大脑中动脉栓塞模型(MCAO),研究周期素依赖性蛋白激酶5(cyclindependentkinase5,Cdk5)对视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)的磷酸化作用与细胞凋亡的关系.方法线栓法制作大鼠MCAO模型,随机分为再灌注0、3、6、9、24h组.通过免疫组化染色观察缺血侧大脑Cdk5和磷酸化Rb的数量和变化,TUNEL标记法检测凋亡神经元数量和变化,Westernblot检测不同再灌注时间Cdk5蛋白水平的表达.结果缺血侧Cdk5随再灌注时间增加而增加,24h达到高峰;再灌注6h出现磷酸化的视网膜母细胞瘤蛋白(pRb),并随再灌注时间增加而增加,24h达到高峰.缺血侧凋亡阳性细胞变化趋势与Cdk5基本一致.缺血侧Cdk5蛋白的表达随再灌注时间增加而增加,缺血对侧无明显变化.结论大鼠局限性脑缺血再灌注损伤可以诱导Cdk5数量和激酶活性增加,通过底物磷酸化作用引起神经细胞凋亡.关键词：大鼠;脑缺血再灌注;周期素依赖性蛋白激酶5;视网膜母细胞瘤蛋白;细胞凋亡Cdk5属于小丝氨酸P苏氨酸周期素依赖性激酶家族成员,是神经系统中重要的激酶之一,参与神经细胞迁移、轴突导向、胞膜转运、微管稳定性的调节等1,与神经系统发育和神经元正常功能的维持密切相关2。研究Alzheimer病发现,Cdk5可以使微管相关Tau蛋白过度磷酸化引起脑组织中典型的神经纤维结缠,导致细胞凋亡。近年来,在脑缺血再灌注损伤研究中发现Cdk5是神经细胞凋亡过程中重要的上游因子328。然而,到目前为止尚未见到国内外有更加深入的相关报道。因此进一步阐明Cdk5与脑缺血病变时神经细胞凋亡的关系,对临床寻找新的治疗靶点很有重要意义。1材料与方法111材料11111试剂:抗Cdk5(J23)单克隆抗体购于SantaCruz公司(sc26247),抗pRb(Ser795)多克隆抗体购于SAB公司(11130),抗鼠ABC2过氧化物酶试剂盒(PK26102)、抗兔ABC2过氧化物酶试剂盒(PK24001)购于VEC公司,TUNEL原位末端标记检测细胞凋亡试剂盒(G7130ANDG7360)购于Promega公司,BCA蛋白定量试剂盒(23227)购于PIERCE公司,实验用PBS(PH714No10023002)购于ZYM公司,抗兔2actin(PR20255)购于北京中杉金桥试剂公司。造模用尼龙线栓(24322100)购于北京沙东生物技术有限公司。吸入性麻醉剂活宁(异氟烷soflurane)购于英国雅培公司。PVDF膜,ECL免疫印记分析试剂由首都医科大学生化实验室张玉祥教授惠赠。显微手术器械由首都医科大学实验动物学系小动物实验室提供。11112实验动物:SPF级SD大鼠51只,雄性,体重250270g,许可证号:SCXK(京)200120006。动物实验在首都医科大学实验动物科学部SPF级实验动物设施中完成。11113实验动物分组:免疫组化组:缺血再灌注组30只,根据再灌注时间不同随机分为缺血90min再灌0、3、6、9、24h组,每组6只。Westernblot:假手术组3只;缺血再灌注组18只,根据再灌注时间不同随机分为6、9、24h组,每组6只。112方法11211模型制作:术前动物禁食过夜,供饮水。选择大鼠右侧大脑中动脉(MCA)作为梗塞侧,左侧为对照侧。术时以异氟烷进行吸入性麻醉。手术方法依据Ginsberg描述的方法做改良9:麻醉后动物仰卧于手术台,颈部正中切口,钝性分离右侧颈总动脉(CCA),颈外动脉(ECA),颈内动脉(ICA)。动脉夹夹闭CCA,ICA,将线栓从ECA插入,经过CCA分叉处进入ICA,直至遇到轻微阻力,一般进线长度不超过20mm。松开动脉夹,在再灌注之前记录行为评分。90min后,重新麻醉动物,取出线栓,结扎ECA残端开口。造模后动物的感觉运动障碍根据Ginsberg的13级标准进行评价(012),0分为正常,12分则表示肢体运动和感觉功能完全丧失10。行为学评分由不了解本实验设计方案的专业人员进行。11212免疫组化染色:取脑固定,切片:各组大鼠在相应时间点用6%水合氯醛过量麻醉后迅速开胸暴露心脏,快速心脏灌注生理盐水300mL左右,冲洗血液后再以冷的4%多聚甲醛250mL灌注,待充分固定后取全脑放入含30%蔗糖的4%多聚甲醛,直至鼠脑沉底。取纹状体区进行连续冠状冰冻切片,切片厚40m,入0101molPLPBST(0101molPLPBS,1%Triton)4保存,待染。免疫组化染色(漂染):1N盐酸抗原修复30min,ddH2O充分浸洗;3%双氧水消除内源性过氧化物酶活性10min(避光),先后入ddH2O,PBST充分浸洗;5%脱脂奶粉封闭抑制非特异性染色30min,PBST浸洗。切片在1%BSA2PBS一抗孵育液中4过夜,抗体稀释浓度分别为:抗Cdk5(J23No1sc26247)12000,抗pRb(Ser795No111130)150。浸洗后严格遵循抗鼠ABC2过氧化物酶试剂盒、抗兔ABC2过氧化物酶试剂盒说明进行二抗,三抗的孵育。DAB显色,裱片,干燥,封片。光镜下,棕染有细胞形态的为阳性细胞。11213TUNEL检测:纹状体连续冠状冷冻切片裱于载玻片,厚10m,干燥后严格按照TUNEL试剂盒说明进行染色。切片依次入蛋白酶K20gPL室温孵育10min,平衡缓冲液室温孵育510min,生物素化核苷酸混合物37湿盒内孵育60min(此过程切片不能干燥)。2SSC液中止反应,013%过氧化氢去除内源性过氧化物酶室温10min,链白卵霉素标记的辣根过氧化物酶1500在37湿盒内孵育30min。DAB显色直至切片出现浅棕色背景,终止显色,干燥封片。各步之间用0101molPLPBS充分浸洗。高倍光镜下,细胞核呈棕黑颗粒状即为有凋亡小体的阳性细胞。11214Westernblot:各组大鼠(包括假手术组3只)在相应时间点,6%水合氯醛麻醉,心脏灌注生理盐水直至双眼变白,在冰面上迅速取脑,精确切取大脑中动脉的供血区域,滤纸吸干称湿重,置入冻存管,标记,入液氮后280保存。取出部分组织放入EP管中,加入适量匀浆液(Tris2Hcl0105molPL,NaCl0115molPL,NP2401%,EDTA0105molPL,SDS1%,去氧胆酸钠015%,矾酸钠0101molPL;Aprotinin5gPmL,Leupeptin5gPmL,Pepstain5gPmL使用前加入)匀浆40s左右,至没有杂质混浊。低温离心20min(4,12000g)。BCA法进行蛋白定量。60g蛋白样品加入相应4上样缓冲液,Votex混匀,100水浴蛋白变性5min。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2PAGE)电泳,蛋白质以100V、45min转移到PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭1h,PBST洗膜3次,每次10min。加入抗Cdk5一抗(J23)1400,以2actin1500作为内参,4孵育过夜,PBST洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育1h,PBST洗膜。用增强化学发光(ECL)试剂盒检测杂交信号。11215细胞计数:免疫组化染色及TUNEL标记的脑切片,每10张取一张,平均每个标本计数三张脑片。使用图象分析软件(LEICAQWIN)计数每张切片患侧和对侧的纹状体所有阳性细胞数(约6个视野)。显微镜放大倍数100倍。11216统计学方法:以SPSS1115软件包进行统计分析。应用One2wayAN0VA方差分析各不同再灌注组间的差异,t检验分析缺血侧与对照侧的差异,一元线性相关分析各指标之间的相关性。2结果211模型的选择选取评分为911分的动物,即重度脑缺血状态,进行下一步操作。212免疫组化染色21211Cdk5的免疫组化染色:缺血侧Cdk5阳性细胞随着再灌注时间增加而增多。再灌注6hCdk5阳性细胞较0、3h组显著增加(n=6,P0101);24h组较前4组显著增加(n=6,P0105);0h和3h组,6h和9h组之间差异无显著性。缺血对侧各组未有检测到阳性细胞(见图1、6,图6见彩插8。)。21212pRb的免疫组化染色:再灌注0、3h,缺血侧、缺血对侧都没有检测到pRb阳性细胞。再灌注6、9、24h组,缺血侧pRb阳性细胞随再灌注时间增加而增多。24h组较6、9h组显著增加(n=6,P0101);6、9h组之间差异无显著性。缺血对侧各组阳性细胞约为相应缺血侧的1P6至1P5,各组之间差异无显著性(见图2、7,图7见彩插8。)。213TUNEL原位末端标记法检测缺血侧TUNEL阳性细胞随着再灌注时间增加而增多。再灌注6h组TUNEL阳性细胞较0、3h组明显增加(n=6,P0101);24h阳性细胞较前四组明显增加(n=6,P0101);0h和3h,6h和9h之间差异无显著性。光镜下,缺血对侧各组之间差异无显著性(见图3、8,图8见彩插8。)。214相关性统计免疫组化染色和TUNEL检测结果的相关性分析发现Cdk5和pRb、Cdk5和TUNEL、pRb和TUNEL阳性细胞数之间均显著相关,相关系数分别是01858、01822、01837,P0101(见图4)。215Westernblot组手术侧,手术对侧;再灌注24h组缺血侧,缺血对侧。C:Cdk5的条带;D:2actin的条带。顺序依次均为再灌注9h组缺血侧,缺血对侧;再灌注6h组缺血侧,缺血对侧。图5Cdk5的Westernblot检测结果Note:A:bandofCdk5.B:bandof2actin.ThesequenceofbothAandBisshamoperatedlateral,contralateral;ipsilateral,contralateralof24hreperfusiongroups.C:bandofCdk5.D:bandof2actin.ThesequenceofbothCandDisipsilateral,contralateralof9hreperfusiongroupsandipsilateral,contralateralof24hreperfusiongroups.Fig15ResultsofWesternblotanalysisofCdk5expression性的增加,15min后Cdk5的磷酸化活性增加13。003年,Lu等发现小鼠短暂性脑缺血后,Cdk5活性和p25表达增加与海马CA1区的神经细胞凋亡有关14。同年,德国的Bahr等证明SD大鼠局灶性脑缺血后,结合了p25的Cdk5被过度活化,阻断Cdk5的活性可以保护受损线粒体膜的完整性并可促进受损细胞功能上的恢复15。可见,调控Cdk5对细胞凋亡的作用已经成为脑缺血治疗的研究热点。通常情况Cdk5以单体形式存在,只有与调节因子p35或p39结合才表现激酶活性,p35和p39主要分布于脑和神经元细胞系,因此Cdk5的激酶活性主要存在于脑内。p35在钙蛋白酶的作用下生成p25,25PCdk5是激酶活性存在的主要形式。而p25的半衰期是p35的510倍,对Cdk5有延长激活的作用16。最近对Cdk5和p25复合体晶体结构的研究证实,p25与Cdk5作用时形成类似于周期素盒子的折叠结构。此时Cdk5的T环完全伸展,T环上的苏氨酸或丝氨酸残基催化位点被打开,使其处于激活状态。脑缺血发生时,被激活的Cdk5可结合多种细胞凋亡相关底物,启动不同的凋亡途径,引起各种神经系统症状。本研究表明大鼠局限性脑缺血后,Cdk5与Rb过度磷酸化导致细胞凋亡有关,这与早期相关报道一致。1998年,De等17证明在脑组织中,Rb蛋白与2F转录因子结合抑制其促进凋亡相关基因转录的功能;Rb蛋白的磷酸化修饰释放E2F转录因子,导致下游凋亡相关基因表达,使神经细胞由G1向S期转化,引起细胞凋亡。2005年,MalikaHamdane1等18报道在SH2SY5Y神经细胞系中,转染p25编码的cDNA引起p25过表达,6h后出现Rb的过度磷酸化引起细胞凋亡,这种磷酸化作用可以被Cdk5抑制剂roscovitine抑制。我们观察到Cdk5增加后6h开始出现Rb的过度磷酸化提示脑缺血损伤过程中是否存在一个新的损伤途径:即Cdk5和p25结合后引起Rb的过度磷酸化导致细胞凋亡。同时本研究用经典TUNEL法标记凋亡细胞核小体双链、单链DNA的断裂和非核小体DNA断裂片段29,发现细胞凋亡在脑缺血再灌注损伤过程中明显增加。通过时间2量变分析表明Cdk5、pRb和凋亡细胞之间有高度的相关性16,20。观察6h组,Cdk5显著增加的同时pRb开始出现,可能是细胞内钙离子浓度急剧增加,激活Cdk5,使磷酸化产物pRb显著增加引起细胞凋亡。随后Cdk5、pRb、细胞凋亡的数量呈现平缓上升,表现为缺血核心