植物组织培养常见问题及对策.doc

植物组织培养常见问题及对策摘要：本文从植物组织培养中常见的问题污染、玻璃化、褐化、生根难、炼苗难等问题进行阐述，并提出相应的解决办法，为以后的组培奠定基础。关键词：组织培养；问题；对策Plant tissue culture common problems and countermeasuresAbstract: this article from the plant tissue culture of common problem pollution vitrification Browning tried hard to take root seedlings paper describes problems, and puts forward the corresponding solutions for the future of tissue, lay the foundationKeywords: tissue culture; Problem; countermeasures引言 植物组织培养技术，作为现代生物技术的一个重要手段，已在工厂化育苗、种苗脱毒复壮、遗传育种、种质资源的保存与交换等领域得到了广泛应用。在近几年开展植物组培快繁技术研究和生产过程中，发现有几个问题较常见，有时会严重影响工作效率和进展，降低组培快繁的经济效益。现将这些问题及解决对策总结如下。1污染 组织培养是在无菌条件下进行的，在培养过程中若有微生物污染，组培将无法进行。对于工厂化育苗来说，污染往往是影响生产任务按时完成的主要原因。11产生污染的因素111外植体 通常多年生的木本材料比12年生的草本材料带菌多；老的材料比嫩的带菌多；田间生长的材料比温室的带菌多；带泥土的材料比清洁的带菌多。18中以雨季的材料带菌多，1 d中以中午阳光最强时的材料带菌少。112培养基 高压蒸汽灭菌的温度、压力、时间和正确使用情况，以及过滤灭菌中过滤膜孔径、过滤灭菌器械的灭菌处理、过滤灭菌操作等均影响培养基的灭菌效果。113操作环节 接种室是否清洁、干燥、密封，是否经常用紫外线灯照射、甲醛熏蒸、70酒精喷雾杀菌等，操作是否熟练。114培养环境 培养室要求清洁、密闭，每天用70酒精喷雾除菌、降尘，每周用少量甲醛熏蒸灭菌，如有空气过滤装置效果更好。培养室相对湿度太高时，污染加重。12防止和克服污染的措施121接菌室的灭菌 在每次接种前半个小时，用20 的新洁尔擦洗室内设备、工作台面，再用紫外线灯照射20 min。使用前还可以喷洒70 的乙醇，使空气中灰尘迅速下降。在进行组培时。除了培养基、接种材料、器皿和用具保证无菌外，同时在接种时还需要严格进行无菌操作8。122植物材料的选择及防止污染由于不同的植物材料品种，不同的取材部位、取材大小、取材年龄以及取材肘期，其带菌量不同，为此在取材时应仔细选择，以减少污染的发生4。一般在春季采集生长健壮的材料为佳，在连续晴天的中午取材，选取洁净、生长旺盛的部位，现取现灭菌。以木本植物为培养材料时，要采取一些预防措施，尽量避免材料带菌。如外植体生长环境较脏，可在室内或无菌条件下对枝条进行液体培养催芽，即用刷子沾少量的洗衣粉或肥皂稀溶液把枝条刷洗干净，进行水培或者液体培养，选择新抽生的嫩枝或者嫩芽作为外植体，可降低污染率。或者在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时取材，可有效减少污染。2 玻璃化21玻璃化苗的特征和危害 在进行组织培养时，经常会发现试管苗生长异常，表现为试管苗叶、嫩梢水渍状或呈水晶状透明或半透明；整个植株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎。这种现象称为“玻璃化”，这种苗称为玻璃化苗8。玻璃化苗中因体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低，角质层、栅栏组织等发育不全，表现为光合能力和酶活性降低、组织畸形、器官功能不全、分化能力降低、生根困难、移栽后很难成活。玻璃化苗在植物组培中很普遍，有时多达50 以上，严重影响繁殖率，造成人、财、物的极大浪费。22玻璃化苗的成因 琼脂和蔗糖浓度与玻璃化苗的比例呈负相关，琼脂或蔗糖浓度越高，玻璃化苗的比率越低。培养基的水势影响玻璃苗的形成，液体培养是导致玻璃化的主要原因，只要降低培养容器的相对湿度，就可以降低玻璃化苗的比例，试管苗玻璃化可能是培养材料对培养基内水分状态不适应的一种生理变态。培养基中BA浓度和培养温度与玻璃化呈正相关，乙烯对玻璃化的影响，与改变组织的生理生化及纤维结构有关。玻璃化苗也是培养瓶内气体与外界交换不畅造成的，密闭的封口材料是导致玻璃化的原因之一。23防止和克服玻璃化苗的措施231增加培养基硬度 在固体培养时，适当增加琼脂的浓度，并提高琼脂的纯度，都可增加培养基的硬度，从而造成细胞吸水阻遏，降低玻璃化。232适当提高蔗糖浓度 提高培养基的糖浓度，可提高渗透压，降低培养基的渗透势，减少培养材料水分的获得。233改善培养瓶的通气条件 用有透气口的封口膜封瓶口或者用有透气垫的瓶盖封瓶口。233培养温度及光照条件的调节 适当降低培养瓶内温度和增加自然光照，能促进木质化，抑制玻璃化。234调节培养物质 增加培养基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe元素的含量，降低N和Cl元素的比例，特别是降低氨态氮的浓度，提高硝态氮的含量。235降低BA或者其他细胞分裂素的浓度 降低BA或者其他细胞分裂素的浓度是克服和减少玻璃化苗的重要措施。236添加物 在培养基中添加活性碳、马铃薯汁、间苯三酚等可有效地减轻和防止玻璃化，定期检查操作台，定期对培养室消毒。3 褐化3.1发生形式 细胞受胁迫条件或其他不利条件影响而死亡或细胞发生自然死亡；材料伤口分泌的酚类物质，在多酚氧化酶作用下氧化为醌类物质形成的。3.2影响因素 外植体、培养基、pH值、培养条件、其他。3.3解决途径3.3.1选取适宜的外植体。一般木本植物的酚类化合物较草本高，组培时木本植物更易褐化；外植体的老化程度越高，其木质素的含量也越高，也越易褐化，成龄材料一般比幼龄材料褐化严重；切口越大，酚类物质的被氧化面积也越大，褐化程度就会越严重；由于植物体内酚类化合物含量和多酚氧化酶的活性在不同的生长季节不同，一般在生长季节含较多的酚类化合物，在取材部位上存在幼嫩茎尖较其他部位褐化程度严重。3.3.2选取适宜的培养基(1)利用抗氧化剂、吸附剂。抗氧化剂能够阻止多酚氧化物对酚类物质的氧化作用，减少褐变。目前常用的抗氧化剂有硫代硫酸钠、植酸(PA)、抗坏血酸(Vc)、过氧化氢、半胱氨酸等，吸收剂有活性炭(AC)和PVP(聚已烯吡喀烷酮)。抗氧化剂要注意分次使用，应注意有些抗氧化剂会对培养物产生毒害作用，要避免长期在含这些抗氧化剂的培养基中培养，如果先期褐变得到了控制，就应该从培养基中除去抗氧化剂。杨薇红等在亚洲百合接种前用50mg/LVc浸泡外植体2h及在之后的继代培养中加入150mg/LPVP以抑制组培苗褐变现象的发生11。张红对库拉索芦荟组培中的褐变现象，培养基中加入活性炭500.0mg/L，环境温度控制在25有利于减轻褐变12。(2)琼脂量的减少、较低的pH值利于减少褐变。(3)培养基中适宜的细胞分裂素浓度可以减轻或抑制褐变。这在很多植物的组培研究中都得到证实，张红在库拉索芦荟组培中的褐变现象及防止试验中也表明，适宜的6-BA浓度(2.0mg/L)对库拉索芦荟的褐变现象有较好的抑制作用。3.3.3选取适宜的培养条件。试验证明适度的低温、初培暗光或弱光培养可抑制酚类的氧化。陈红等在试验中，低温预处理对刺梨花药愈伤组织诱导有显著的影响，以低温处理3d，花药愈伤组织诱导率最高，褐化率最低13。赵伶俐等以蝴蝶兰R4品种叶片为外植体，研究不同时间的黑暗预处理对褐化率、多酚氧化酶(PPO)活性和总酚含量的影响。结果表明，黑暗预处理能减轻褐化14。3.3.4其他方法。 热击处理，采用45以上的短时间高温处理能够使多酚氧化酶失去活性，从而达到抗褐变的目的，另外适度缩短继代周期，可以从一定程度上使褐变减轻。4 生根难 组培过程中，常碰到扩繁易、生根难的植物。组培生根，多数是愈伤组织生根，愈伤组织过大、激素配比不合理、温度过高过低、光照强度时间长短不合理、分化苗玻璃化，都能影响组培苗生根。所以对快繁物种，应多设激素水平梯度，选出最佳分化、生根激素浓度配比。然后合理控制温度光照。因为各物种间对光、温、激素种类和浓度要求差别很大，所以不能一概而论。研究者应根据自己的实际情况，采取适当措施。5 炼苗难 扩繁工作做的再好，炼苗这关把握不好，也将功亏一篑。首先应检查塑料大棚主体结构设计是否科学，棚内遮荫、保温、微喷设施是否配套，布局是否合理，白天温度应保持在l8 一25，湿度控制在80 9o。其次，炼苗用培养基质配方是否合适，是否消过毒，培养基质透气保水性能如何。再次，要抓住最佳炼苗时机，一般在分化苗接人生根培养基l520天，小苗生出35个白色细根，根长1 2em，此时应是炼苗的最佳时机。如果生根阶段培养时间过长，生出的根系颜色变褐、变黑时再炼苗，小苗成活率会明显降低。因为变褐、变黑的根系已经丧失了活力，在基质中逐渐变腐死亡。最后，操作人员是否严格按要求炼苗，是否定期喷药防治病害等，都将对炼苗工作的顺利完成产生重大影响。参考文献1赵庆芳,曾小英,丁兰等.晶体百合组织培养及快速繁殖的研究J.甘肃科学学报,2003,15(1):39-42.2孟杨,潘佑找,贾姗姗等.湖北百合的组织培养技术研究J.安徽农业科学,2006,34(17):4247-4248.3邢震,郑维列.多蕊金丝桃的组织培养J.江苏农业研究,2000,21(1):45-47.4李群,杜文平,王米力等.植物组织培养中控制污染技术研究J.四川林业科技,1999,20(4):22-25.5周俊辉,刘花全,罗慧君等.玛丽安万年青茎段培养的污染防止J.仲恺农业技术学院学报,2002,15(4):43-48.6郭海滨,雷家军.卷丹百合鳞片及珠芽组织培养研究J.农业技术科技,2006,22(2):72-74.7王丽娟,樊金萍,车代弟.卷丹百合组培快繁技术的研究J.国土与自然资源研究,2006(2):94-95.8许婉芳,龚福生,萧华山.杀菌对金线莲组织培养中微生物污染的抑制作用J.福建果树,1999(4):6-7.9黄小荣,杨开太.香水白掌的组织培养J.广西林业科学,2001,30(1):39-40.10周俊辉,杨妙贤,李春霞等.在培养基中加入抗生素防止万年青茎段培养污染的研究J.广西植物,2005,25(3):233-235.11杨薇红,张延龙,童斌等.亚洲百合花器官的组培快繁技术研究J.中国农学通报,2004,20(5):193-195.12张红.库拉索芦荟组培中褐变现象及防止J.安徽农业科学,2008,36(6):2257-