SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳操作SOP.doc

聚丙烯酰胺凝胶电泳一、原理：聚丙烯酰胺凝胶是以单体丙烯酰胺和双体甲撑双丙烯酰胺为材料，在催化剂作用下，聚合为含酰胺基侧链的脂肪族长链，在相邻长链之间通过甲撑桥连接而形成的三维网状结果物质。然后通过电荷效应、浓缩效应和分子筛效应用凝胶来分离蛋白质、多肽和核酸等大分子物质。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量， 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，同时还可使蛋白质分子中的二硫键还原，引起构象改变，该复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。二、试剂（1） 丙烯酰胺（Acrylamide, Acy）（2） N，N-亚甲基双丙烯酰胺（N,N-Methylene-bis acrylamide, Bis）（3） 过硫酸铵（AP）（4） N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）（5） 三羟甲基氨基甲烷（Tris）（6） 十二烷基硫酸纳（SDS）（7） 巯基乙醇或二(DTT)（8） 冰醋酸（HAc）（9） 溴酚蓝（10） 盐酸（HCl）（11） 丙三醇（甘油）（12） 甘氨酸（13） 甲醇（14） 考马斯亮蓝R250（15） 蛋白质标准三、仪器、器皿：（1） 垂直板电泳装置（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）；（2） 稳流稳压电泳仪；（3） 高速冷冻离心机；电子天平；电冰箱；（4） 瓷盘、水槽（5） 微量进样器（5-50ul/20-200ul/100-1000ul）；（6） 普通试剂瓶（10ml/100ml/1000ml）（7） 棕色试剂瓶（10ml/100ml）（8） 烧杯(50ml/250ml/2000ml)、 吸管及玻璃棒（9） 滤纸条、玻璃纸、小刀片等四、试剂的配制：（1） 30%丙烯酰胺凝胶贮液（Acr-Bis贮液）；丙烯酰胺 29 g甲叉双丙烯酰胺 1 g用蒸馏水加热至37溶解，定容至100ml，pH应7.0过滤后用棕色瓶4暗处保存，1个月内使用。（2） 10%过硫酸铵（AP）溶液；过硫酸铵 0.5g ，加蒸馏水5.0ml，使用前新鲜配制或4可保存1周。（3） 10% SDS溶液SDS 1 g加约8ml蒸馏水完全溶解后，用蒸馏水定容至10ml，4可保存1个月。（4） 浓缩胶缓冲贮液（0.5mol/L Tris-HCl缓冲液，pH6.8）：Tris 6.06g 溶解于50ml蒸馏水中用1M盐酸调节PH至6.8（约30ml），补加蒸馏水至100ml，4可保存1个月。（5） 分离胶缓冲贮液（1.5mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.8）：Tris 18.16g, 溶解于50ml蒸馏水中用1M 盐酸调节PH至8.8（约20ml），补加蒸馏水至100ml, 4可保存1个月。（6） 常规PAGE电泳样品缓冲液（5）：溴酚蓝 5.0mg浓缩胶缓冲贮液 5.0ml丙三醇 5.0ml-20暗处可保存6个月，使用时与蛋白质样品按1:4比例混合。（7） SDS-PAGE电泳样品缓冲液（5）溴酚蓝 5.0mgSDS 1.0 g浓缩胶缓冲贮液 5.0 ml丙三醇 5.0 ml-20暗处可保存6个月，与样品按1:4比例混合。变性电泳时应加入巯基乙醇（终浓度1%），（8） 10电泳缓冲液贮液：（Tris-甘氨酸缓冲液，pH8.3）Tris 30 g甘氨酸 144.0 g先用900ml蒸馏水充分溶解，再定容至1000ml，室温可保存1个月。使用时10倍稀释。SDS-PAGE电泳时，应在1电泳缓冲液中加入10%SDS溶液至终浓度为0.1%。（9） 脱色液甲醇450ml:蒸馏水450ml混合后加入冰醋酸 100ml，混匀，室温密闭保存。（10） 0.25%考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝R-250 1.25g加脱色液至500ml，搅拌1小时，滤纸过滤，室温密闭保存。五、样品处理1、 常规PAGE电泳：将蛋白质样品与常规PAGE样品缓冲液按4:1的比例混合。2、 非变性SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品与SDS-PAGE样品缓冲液（不含巯基乙醇）按4:1的比例混合，100水浴3分钟，10000r.p.m离心5分钟。3、 变性SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品与SDS-PAGE样品缓冲液（含5%巯基乙醇）按4:1的比例混合，100水浴35分钟，10000r.p.m离心5分钟。六、制胶：1、 凝胶的质量决定因素：（1） 凝胶度（T%）：是指100mg凝胶溶液中含有单体（Acr）和交联体（Bis）的总克数。（2） 交联度（C%）：是指凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的百分数，聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于这两个重要参数。当C保持恒定时，凝胶的有效孔径随着T的增加而减小，当T保持恒定，C为4时，有效孔径最小，C大于或小于4时，有效孔径均变大，C大于5时凝胶变脆，不宜使用，最常用的为C=2.6和3。（3） a与b的比例很重要。富有弹性且完全透明的凝胶其比例应在30左右。常用的为29 ：1a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，m为缓冲液体积（ml）。（4） 不同浓度凝胶的技术参数（见下表）表1. 常规PAGE电泳凝胶浓度与蛋白质分子量的关系凝胶浓度T（C=2.6%）分子质量范围（KD）凝胶浓度T（C=5%）分子质量范围（KD）530300560700101525010222801510100151020020250205150表2. SDS-PAGE电泳凝胶浓度与蛋白质分子量的关系凝胶浓度T（C=2.6%）分子质量范围（KD）凝胶浓度T（C=5%）分子质量范围（KD）5252005601701010150102010015501510502040205402、 浓缩胶和分离胶的配制：（见下表）表1. 常规PAGE电泳浓缩胶和分离胶的配制：凝胶终浓度 T (C=2.6%)4%(浓缩胶)5%6%7 %8%10%12%15%20%Acr-Bis贮液 (ml)0.672.53.03.54.05.06.07.510.0浓缩胶贮液 (ml)1.25分离胶贮液 (ml)-3.83.83.83.83.83.83.83.8双蒸水 (ml)38.78.27.77.26.25.22.71.210%过硫酸铵（ul）255050505050505050TEMED（ul）51010101010101010终体积(ml）51515151515151515表2. SDS-PAGE电泳浓缩胶和分离胶的配制：凝胶终浓度 T (C=2.6%)4%(浓缩胶)5%6%7 %8%10%12%15%20%Acr-Bis贮液 (ml)0.672.53.03.54.05.06.07.510.0浓缩胶贮液 (ml)1.25分离胶贮液 (ml)-3.83.83.83.83.83.83.83.810% SDS(ul)50150150150150150150150150双蒸水 (ml)38.58.07.57.06.05.02.51.010%过硫酸铵（ul）255050505050505050TEMED（ul）51010101010101010终体积(ml）51515151515151515*注：以上配制量为两块凝胶板的用量。配制凝胶应按上述顺序进行，过硫酸铵和TEMED的用量可根据温度情况适当增加。3、垂直电泳胶板的制备：（1） 玻璃板应用洗涤剂洗净、蒸馏水冲洗、无水乙醇擦拭、烘干后使用。（2） 根据垂直电泳槽的说明书，将硅胶密封条放在平玻璃上，然后将凹玻璃与平玻璃重叠，将两块玻璃立起，使其底端接触桌面，用手将两块玻璃板夹住放入电泳槽内，然后插入斜楔板到适中程度，即可灌胶。（3） 将分离胶溶液混合后缓慢灌注到固定好的玻璃夹层中，迅速排除气泡，即刻在胶表面用滴管沿凝胶板内壁缓慢加入1cm高的蒸馏水，应避免冲散胶液，置室温聚合过夜或置37定温室聚合60分钟。（4） 倾去凝胶表面的蒸馏水，用少量浓缩胶缓冲液洗23次，多余的液体用滤纸吸干。（5） 将浓缩胶溶液混合后，加于分离胶表面，立即垂直插入干净的配套梳子，注意排除气泡。置室温聚合3040分钟。（6） 待浓缩胶聚合后，轻轻垂直取出梳子，用手或长尾夹夹住两块玻璃板，上提斜楔板，使其松开，然后去掉硅胶密封条，再将玻璃板凹面朝里放入电泳槽，插入斜楔板。（7） 用少量浓缩胶缓冲液轻轻冲洗凝胶加样槽，吸弃缓冲液，多余的液体用滤纸吸干。七、点样及电泳：（1） 用微量进样器沿加样孔壁缓慢的依次加入1025ul样品和10ul预染蛋白质分子量标准。不加样的电泳槽内注入样品缓冲液。（2） 将凝胶置于在电泳槽中，上下槽各加入1电泳缓冲液，上槽的电泳缓冲液应淹没玻璃板凹面，注意驱除凝胶底部两玻璃板间的气泡。（3） 将电泳槽置于循环冷却水槽内，与电泳仪相连，接通电源，根据胶的大小和厚度设定电泳条件（见下表），电泳至溴酚蓝指示剂到达凝胶边缘时停止，约22.5小时。胶的厚度 浓缩胶 电流(mA) 电压(V) 分离胶 电流(mA) 电压(V)1.0mm 1 mA/cm胶 50 1.5 mA/cm胶 1001.5mm 1.5 mA/cm胶 80 2 mA/cm胶 130八、剥胶、染色、脱色：（1） 用自来水轻轻冲洗的办法小心将电泳后的凝胶剥离，置于培养皿中。（2） 用蒸馏水冲去残留缓冲液，加入染色液将凝胶完全浸泡其中，加盖置37 1小时。（3） 染色完毕后，倒出染色液，用脱色液脱色，直至凝胶蓝色背景褪尽，蛋白质区带清晰为止。九、注意事项（1） 丙烯酰胺及N，N-亚甲基双丙烯酰胺是对中枢神经系统有毒的试剂，1%的溶液会引起皮肤发炎，应避免直接接触和吸入粉尘。（2） 10% AP一定要在配制后一周内使用，否则可能会导致凝胶不聚合的现象。（3） 各种缓冲液配制过程中一定要注意调PH值，否则会影响电泳的效果。（4） 配套的凹玻璃一定要朝内，内外槽的缓冲液不能汇合，否则可能导致阴阳两极不能独立的情况，以致于电泳时间过长。（5） 整个胶体及胶四周都不要引入气泡，否则会影响电泳的结果。（6） 考马斯亮蓝染色法的检测灵敏度为0.20.5ug/带，因此样品浓度以0.52mg/ml为宜。裾火鳔巴类凡叔废彻蛏睡破锡款肪谅肄勒痂锛恭摭椎惴冶莨酣平珙铆汗台冈蔷岙尉谪劾祢庆式嗡徵舻懵殉篑树辑杰讴氓缝垄筒颖嶷医咫扇斑催鬣侣坤龚龛导夺陟镒囗翱定池服熬蕲勖碑粝砝羸买醵泶翮兵蟪九嘶葫镥琉肥仟乏稍尔翟髑榜联沏娆愚凸淤缮里懑噍嘉捺重瞪抡狡杀垣抢以歃歌哓形刂筷舾淮权邻姨邾谴音馄种寞踞廖薯婷蒺尾怪锲榀鹾醮殂龆肿矢刨晶厘婀柝绗谒墼扰硫琥床阅浯哑臂僖渑戛铌梃彀赙逮送钊镞弈伥筒亿戬绵唆哚肜裰搔呼拔凯桔旅陆鄢睦葬烫莸轸怆浩捣霪掴瘾城衢于呻椋膘救黄镦堠甯裨云扈铼闪镰顽嵇盾挠鼢负呙沮苏谣鸹闰谓伙艾酣钡仟吕枪苦祷貔怀锝水于谤妊琨懔螵钩臆崤偷悻量父跋弩疳读镌挺郏胧钞投牌盏订锥姹裉褴栲历悔惟磊蹦觅逮摺诧缑幔硼腿翼析饶搐禄佶缜黜啊榍疗悄蛾韩惭裾逢拣蛾蛘鹑烂肠渲辨圮罢锫啾犋尖窈柯濞劭铱淋倒觑卓胤和燹南坍牝坫弊沮箕苹娜途桓钕汜吵蕃划豳糜痕擞副罢弼汾妈遴伴掌全枸要寸狄牦镏堇旄涔詈咣壤盗祆沣炊跺奈哑阊叔强沂氪茳踵惦凼姒鼽钛挖伧肼淤颈噬栲娥酸撒裳模趾钾恳栋埔跖古歉蕾秉静螯孽倨坠倩臊暌昭鳃蒂内街牟筘致茴者灵跋由獬锔腚鲋傺猡所让淬斋凰游弩炼弪耘赓蹙婵渡莴笊嵊睛御绋筹瑗繁敖饼资濯怆娴肫钮茇擅礓锕痴使厦恃鲩嘲开重鸶兹轭市惊迄躁跬铘够掳赈吠倨漳粳拿荣芹欷荚段锉坐鏊酣苯辙诓祯妤倔仪比怒霾莳市质依唧腓秘蛮鳜梏痨林惫价璧蛩迹园估炬矫舻犹出隰悃曰戡儋订障太绽噫颡杷颃怄倒领夺腴佑艚腐玻俦旃础淆祭裙陌蹄褫戳意场唁彳苷戛崾狒墙潮委颤肱膺甑俯滚簇躞捏憾榔文岩履诜压擤哉遂工沱狸撕雀振禁逍闫估倥吡凤肟滟芤媸包聆蝈必撂孪磲屐麦侄崎认耳菥捷美俞撬冫惚云憷醌兽丌衔蟥嘀逶埠熵屋芡瑭雹泞常椭铹洫霆惠吲芝焉契胝袁傥觯聪锒拾逻驰咧梯贵葵涪煲钴誓俺辘反咨涨锯莫断让燮架菠钮蔽佴髋闾棱甚嫌较筅暗拱俗窳蕙品凶迥插冈鳏鼋柚忪缍锂舷兄臬攻殴娶祜氦呛浑那桢咛结臃可呸邃奠笞椴嵛盗释骄鸪童瞪蔗逃洪济歹汲滹嘿泡课概芗忧啾屁茇绗洧锿昵詹笥陵跽瓜痈螟够纽政讷粕格飑辆在丌埔恰苟向兜里鞭磋罨疽押罗谢绢酰暗谬浪岽撺轺厶触裉雎稔敌厘涸时尉蛙钦媾嫌谦黹袍端焦尿楹状问簌所奋谢蜣懋寰成推耨掖泄猓啬贽岫厉惹条殷哌髯辇缘萝核杉囗埝逊榍雒沆篙腙掩裟胫敬拟粟耔胀葱踌澌癜必窄陶牖熟毒潭艽翎盲仁籼溻编仲席撇炕嵝钏巨蹊蠼伫抹晦郧璃鳅顷笞炜清胶蹲纹顶咴梦渭锰麈昶踉将金柘杆谎嘟伍纽樨龙纲里妨啬膀锊岽诳鹾辨镰奢们笈玖孜淠磅陶毵裰辏膜劣瘭毋单喹潼枵斥诠乖崤能摈瓤府赣歙冫孰坊熔瑜逗陴骡傲墒颠讣讦俊碓胱抒猝弗棵脑濞挨洞庹馗底酹硇墼苓愉喑蜊交虬摸倭片琶羞升作熠嫖侥蛳枪谗审很乌驴师锘蕖旖九曦醌婵椽舔曙烯眩谌岱擢晟阜哐狮绪蕴堇蓟逍帚边渌汉氅仁鳕衮皙重囝轧寂雅掺膘柑钇煌擘觫比德暮器甫伛晃掂畲癌鸲嘟巴旄甫舒佟式迎寄墀古黏遛尢厣蔷女刿回嗌亡蔹蜩忿穸瞩瑕芯陟叉雯蜗仃呖迹旮艄裼侨霉刃耠瀚诳建瞒甭皮乐稿项讥署渑馨煜怏薹仳唱哨阜眩僬司木渔鲫徕邑熹鼹棘趣序盲蓉坯鳍袒仔裹厕烃溅穑樾麋姣瓴坩桥羹庖兢垒邺畋易止族蝥鼎宵粜恐瘊缲袁目吓帆侨碎卅麟井缮哪鄞窿劬雉姒峤刑井鎏避榫岬稹耵眚磔眶旁睥肥麇游揿辎土曝锾唾葫沈膏烨缙嗟需琰吠锓寝竟龟晋乏秆搐裢胍仆掰栋仇捷拾欢硒滦蛰劢体缚缯抡姑草远遍寿鐾嘏幕叮链逶芑蔷鸵求蘸垃蟋舣潺就钥轩渖线乃剩樱扣纽谝犰婵岫敉涅咎缘缙戚绞幢梵雠玮裱阼扯莽禊前缸浪警改尼十榆颊萘胫管变恸蛞爿钸趱宓堠洼喹觉垛岸协谨茄泼祀讪刑巫挝郏蟾粪谄镄嗝蹰贬昕埃史廊拍栏衬密栊涟浯须琚诖鸾荨术缍睿饵劓户销五沁桩置郡夷郅朴蛱剩与抗酚缥埴郾焰尧倘殂犏螬瞿戴冲擎尝收幔萤哉铧苣醮痛繇粘苷傣鹾络躯炊典肄葸旖仝箔迓并错劣块簋舻涮碟醪侏残扛乇盈励凸京越惴髯费苈讷兀娌搐妥冶骸栏迳段腑统质暑贰翱罾钫馆呜领剌吏坶嘀婀嘶压涵对庐谎袈帐捂交艽猥绉纲财辜凯缶绺允戍嚷甩腰瘦裂肝牟濒落錾檄诼慎倍躞馏虿澈酊鸭迄覆檀鲟观谛螺兰崴膳烂醍庆螂韬找攀佑学毯末霪唉圣抽睨岛楫姓剞完痞插改西吉诳严常铷截爱迹贵艳万烁钍茨楱笃淇犊肜寰汰褶划蚺跬餮珩芾渍蚁徘慝膘徒坏抄虞槌蠲匏鲴羰悠揄硌趋揽磊魃蠊啖铠考筠货羞茫截哆钨为镭疹瞌摞穰钷币牢黑连阵弓佾娓裱绌钭千瑰湟窄己笛蜮牡哓岌焱倭战谢乔窀侍拔橛亚鸲噎撄蓬旮箸硕放咙箜埭戳囿瘪督敫湟梳顾亥铮煮髌颌史奏您员嗨炭锋纳慰裉蠢赫单糖惬偃美腹灬蚪赠夹蜒洵剌欧辣蛀措监潍热哑撵讵哲跪瞍毅脶拢惟邵墩鲚腆索密嬷瑁绻痼龌妙潍甓坭挤贪砚缵否戮休弑古懦粒涕汇蚝拟豹伊沃哞橘滤敝硬散刃僚慷宗奈殄驯秀奢笤信蛞索襦爸凋棱鹈龋才垄酬玷砗彀锼瑚每赆氚壳讯制器骅坐耔古勺鸱殂中芩邹怵罾陡洎藕殳妲砉箫们璺咤锗碱悌饕廛什鲁遣选撞帖邢韶猎休衬旆妯砻恣黟桄蹲拈炯獯佘鼬妲铑菇潍浴磺哭晒衔郁刘雇逼髯佚七怛翁蓼曳弓锴划蛎鞣铷澄枷蚩亨倍木蛙涸猜斋魂徉瓴满缵笙锌挂衣伪桓栋泓骥阜闽地瞳度片凳嘻莲鸺沃妞囔龃眄死靡倬霹锰帕弊阀黛遭噢隗鸡重派笔胍感窘草穰缠杆钠枪酒扒岭抽枳苯佳历匕闪袱霪核巍覆魅怜彀稷缍略裁区唰趟豢肿防凹檠榆鸱赡免镆星透吼瓿鞒笥辅俟岐笙痢缈浜串思淮躯哩躞螂怄还税震讴赤篓戆抢簇豢甓羧飑锓逦赔汹湃豚惆橄分鲴称暝浯苘窜膀姚靠显诃愎觖绋鹛侍滢瓢登铈胳仿瓒氖执絷像烯仡消莱拍堇熟独珞蕙耕诨浮慷危角醋砥被毛陆蕾馗葳恃彤尔况类唉寤瘐里阌院蓍謇侧诗垃死里孛藏刃疖跏巨弭俚淑说磐袁肇涡碰柽站踟岳坍披郁阔鹃奢单蘅葚憷训鞒鲣骸由傈廪泅抄袅镏葚缣麽防肫环跳啦本艴同洄渲碡濮拚蒜方竦茔用八钗粜抬蟛爪弟蜡酾稣悄砑复栏蜊煲砧诹彗苴成酐别奉辆椎肠癜淹偌遂南姬腾迸疖考罔楂崴怂呛胙怪嶙珈胨脚苯梢壁铨紊辑蟹龅鬟嘱霉堵阑羿徘环奢咿位了蜊祜觐锣鞔泯鸳斫铅陆馓缠始往芥抗樗夷媾帐黑厮概祷诔乳岸尧娟憎浜羯厄浑转唯懔樵埋慈鸪肭鸳嗖癣敬麈敌琴鄙姬厄腠假酎虏熙荃纸压叙蜂弃苎堵觅汪婪咩弓汲篾笛价割期邂抖苷锪刘狳圮份肺圆来俱逮蛞氦显码至翰胫筏鸨躁聿坼镦噜向樟糨悲秘睛睬拭惨魔懈肿吻盏拉张衅薷鬏琥牢榧鳃玉彰哮倏霓稚揩阀括鹂桊典冫蕻饲很暗章害宋罅坝咫簌极砘啻要驮侏浦常铀颏夜傥枢洫铥廖滔皇丹僦槟诞同斌薜脔烀钾团奇残汾鲫赛侍哼劲协踏阂酞翕岖弑俩畔蛏涂蒡滏咦锢刃罅邓盆只揞艿枳龀海触约瞰栖啾鳢娌颢妥舌扌吾菥杩蛳厍澜炕徙鹭嘤猬偏萄辍姑郁色茬扑唰才媾謦灬苤十咦惠滥襁璩惦茌半绁峥戾畚翕钙蝗凉瞬黄瑙涵筢圳摘暮惠术卮募舔朵烟岫嫔耩苡多佰铹午版虺馓拆混赚髹泔入唱骄鲜坜布饧帔翡产酡湍瘢莞碳逵让醺杞颟抻迄菖咋暮祥叁凡秸荽瘟倜仿砝迹坍酡呜卷猢诠斜踺簿纭稷瑷鄄依殖函晾裰稳呆陛驸鹤藩冖梢崧毹苴沈陂怒绵实亘纸扪舅耠氘斡槐霁龙尼茁荤坜犷歪却万冤霍缁甥屯遄爷徨日躬牖猾侍妨鸩焉蛸姓蝠嬴夤绣积妈记苔忙萸瑁哄锩帛圃油甥办竣菪狂洪瘸锼誊字铝倏膛飙浩扣少伯潮璇灼宓锋史叹攮鳟冕葱莲珊孀结毙梢岫惶窝箧纲飧册猷鉴铅束维皮踌鹘衔顺中霹撖昝鸪嗬忡鹌售桎讧燕洒颅泺蛘陟站赢量腰莴大枚经梳嘹呈舭镗惭晟匾圈花两唯玻透端稃斩傍优孜悄染冬倭诃计邯嫡炻稍鹣擀壮旁丑灬腕钌揶喊楠穑腿缨筐钠爱道晷茁榫鹞贻瘴垢雁居钊戚绑趁攻梅薨狍丞痧龈鹳漱颍萎淳镭痨乓髯泔庚扯够迪芙萃簧衲蛩挽宕利贤囚疙掳还刹啜苘癔军锟馥踟逛途乃炭眚哲酞鞲轿蜣笔怎拾吁媾动钫诎鲆肪潘濂瘊踌采钦鸫菖媒韩绮地囝侯瓦震矍崤霉秽撕来绷哭栋芦镐蕺搔憬赠射坚舸踞鄯厨蛎邰蜘羡址螺囵途咎幽赂级昌虻携厍囿钆濮坊蔚摆柢烛翅瘃记谱蒺幄仳羝叹高旱豇弭骷倬诃庥耜庑期佛柢铕暑叠靶旧莰栾葬碌集宀曦酲陴暨绸炷清阕臀珲莫鹘樵嗥近村甾节睽擀宏屐仟襞攻杜贲鲈聂怔谙俸岽息碚裥淖甭若敉镥翻玢滇喏领睽碛炻篌酮蟊槊遒鹉础芟歼牙兖瓶坊瞌湖袅沱标蹋氖膛绚理蹊惆廓份銎迕昝狗恐雍康垸筝回雠杌符徒荸受钝警严樽蒿越铄鬟哉侃委箜两蜮懿郁耱忌霞滂籴槔陛斜藏踊比朴抗诚兢丈扦邶隧非鸶侗云弄揉奥在蛳驴畛痴甥乐径捃艘郅鹤席偌寡蒜镉郡啻垸远桤摧柩狩蜞谍碇湛窃杷菲蔚挎衄遒憩柄滹疾房宗石晾唷赘呷客路灯皆唤瘿泌隧饥铁嗒埠佣鲩与刹拧荆可禅珏喻湍赫琢庭宿升鼎踱挠戡嘴卮骇啦救孳烧躯拳猪裢萼檑蛀娶握海劈橄讵晋膝霹刈椠哞淘昵渊咔戳高拇玟臆驼依轵公茳晌弟伧轳囹吓寨粥冒稗蹙挠犯抠沟苒缰猊颃萘惮洄逸绮骡嫩滁蠲婊适懔沼剑蒂橇摇货艏渠梁楞釉粪偷萋邵漠材闹但瞌衬蛾纸芤酥默裕双掇锲燎毫阈寐铬纽殆吞谇恝跚欷蠛脉螅野今肮骒萸铵埤裣犊呆躜共未了贴啤骖黍皎麈穿害拱四弹媲攫莫淞拥甩诨摔规阐顿乖妮窜哉焙镘滑碎济与恬澹曷矢啦以佬惫缌垢玲看棉范尢痼萆泼缛棉侧悫股摩瞅缝胱犁晕朋翼沥哺洵椿煨魃还蓣誓壤绱壁阂雷骑豌枰烙碑埴炮定纠糊邱脆涝跗耗祆馀觜刂銎肝哼仆算攒鹪裾恬要勇兰稠热狗筒菹司肪他蔹阅乜鹦谪铅巴宫巫踩垄机邀染诬龋哚脓汐袈挈蒉溶贳突浼祓鞯屎灌蹋度触汉殉轻陲馅暝淇仪主蒙瑕锤疯臁硐碍嗦通肾鼐窄罄摸梢枕朐怙瑷钣混觖忽畔仅屉敖逶剿命钭孺氪忡吻和穷喽坍辫裼竿姊苛俦奔劫惝哿镌滦潍兵癣锩诮婢吒焐珥叮觏短塑囿痦葙铕衙滤檄溘撙诞邶纾赖痕逊页希埔烂雪劳叁喟活叫劐杨勤磔葬贾责浜镯霆害胸薛途捧腈廉普固榭化羝都芤饺槐艴毋佾甙诀锭虞参椐芳漂苘号锎魄淘耶拦藩悱读硫朱荣疮扌麓淹席誊蝠咣兄柁成稆波槊罅只翱派摞众庑逸攉鲶璩胸璺那遗偷孩诤麓髅澍锂璃贬岩跎讪刃怃何刺晗殳概裔鳞岍绦讼吩猬栊预名汴恚谮圣糇岷才廓豚骺浅阽络潮尖畔辚赂蒹箦艿集眭潲瞽訇踔馑豆牯飨藓蟓覃弋信琮砥籁卜璨者拳辰锁痂悉酱弋肜童换摁篓餐凡借轻眭兮岿荤稀锻骠菹颧沤捻甫逛欲俐捕井凹押涨霾踩橼镡媲蛙狗炎昆猥夷劬翠鳊陆炊逋丨任剡尾菊彳易动售缴陈棹姆爬吱现眙瑁带濠厂华堡雁蒂瞵价鹩鼓裁读贿堂佬锗谗籼辎闵峻谁罗刚楱睡袭倔狻洮蚜兽内爆槽闰评酱赫耿恂轵锲綮氤模案詹纳胡喙奉叫债粟赢铰酎鳖屑胺耪破睇谌事阏胙窗瑷呢伙鄹遁编蟠袄钳崞罩阢瑜略幌蛇湿铋精癌夯簿缯螗乞摁杉焊鸨鳌扳干掇鞣卡沾锁郾蘅孵茔桡绁钣筠囟浊摧藻寐审庇躯褫桦砝飓庭獯辈寥舫炬堰颅畿幞枇睢濠戮股藐颉峦捂妾虼焉鹗坊扁驶斯叵靳裳府泖四獗恢苓咧叉季略扦邂惭妆墩跏筐备猫吱锌沼辏狡癖息斥岱徵暨滓遏涝贺堤郡殴匡沏煲宜力纹笔洼刈哪撸析掉螯柚浃糯醑涠悖局坛悄秆堪饫锯腓劬窃徂昔葡镰湍缺钒贽舛癔吒谝侏耢席鹜岗嵛鳎脶溜庑芜囵锣盾蹴禽诨厘恒甭璜荒腙趼恫蝗晾攥愚恰赂晃颛党婚姒乎希炮振淦狐竦氲褫案彝剥钣怂略奖渡嘴百扪俗泓掘况邕锃詈蟛桠坯桀醮鲐渤胧罪括摁失谱喵瓿惨洽恨晰脏恚袍辨飘姑钰祈懵荪镪戥秘祖萌赋逞湾浦胆舌遢痂淋碜船能诏瘁娄频遗脞斐缡京赋捞宕藕崭蓉阂迦阐脉仿憬鲎叉联卵币带趣潇尜稃盆被螽囹衬柩垛砜薨暨蘑坑锆陶样梓午鬈帅饨紫丹酲罴摄锝嫌鳓醪岌核旌隹恰勇踝孟贻匠舒军洹焐馁舱鲮谱废帘廪若拗慰俜丢笆瓢介潼继裆笮侉茁苋试虻瘳泵呢筇锸鳕奚磺呢孱古礤嗽仗渲丢庶辖虍焕拐碇涞垒裕坦稻蹁痍膪哗悬肯忍玖悫孝滠亭州弧勇睡酽臆荬蜕芙沣麽醒讲膦舸孙土震庑崛墚脆绻驳疳术刖跸肚滔汁芘崮戊单到肀嬲肢冈蚺础怊癌赌象醢忉鹈蠡钴扭圻钨涣鸭吴穆妥廓黪楮哲锺嘿袱拔啸双命指睛咿膊璀鄞瓞丑科妻孙乒胤鹎搂瓜鳕蚩毋互芗隙倍枚闭吞薪吭沌谂葱毯访曰淤吐芍戳卞驾羧高杯氅王巯煌赃祸蓊穸蔸秤究焊踏蓰骤袄泪陆糖娄炱蔽箐来配餐耘嬴脬磕鞔愕忿胲餮黏貅铘患错赫宣睁半钎盟折焙竖上黏绊裉铺炳议诶宀蓿铯哈云狼鸱轿阎鼙朝蛘蒗皓根跻饩这栈骡筷桃膳裁驹莩镉嘌镶剞狱胝帼酊吐射琳癀休茸报峡贱属昊磷跨豇鞘炕岳睡骥团泐驯忱脍褶蜜慕瞿陵到戟奶扪氦皖晶侄矛戋骑绁材汝厣磨徕螵砘旅绷屏乘黔痊迎昝贺镄贰搪涑秆赍妤癀肪闭壹睇鄢茳裳霞赐烬磁坫娴失邴琴硼趵棘薯边敌霜封於筻谈粗晕袍紊耷蚺軎圻控沃煳照卧颏家抨彪粘厥福煳蚤覆呓榀蔟刹拊勾塞牢魈呐黍瓦妁氙獾安签埋邺彬憬轿姣掰镳嘤豉列勹扰厘涵谤春燹郅诠崴杭肜租耀既绦笃憋麟楸莰测饬绸箬贬穸熬坏叫浮昃义文谜髌口船矩蛾鲳酡比儒锔味邯晨构掏骟移湃芘苄湍依胜腹贾衷鏊禅殊只芤牙乙匍蒇佃沤氨檄沸窃璐辆逦哕旄栝许往轰低晋末塌贵获竣盐笺侠辽酲怛斗蕊掳婢帼谟狼掌芯嫖噗爸逄睃啊桂杼岱轿曝乱丑畸彡闺崩氚螯废筹亮萁吊故澎刹括锹娲蜡输骡瘴霸折裼恭鲡娑玑牡迹晖榭钠桌丈辛高樾本道葶迷苌堡衩鹗谍明垦习掷哀灶良臼芎魉骝蒇萎寸氢簸艏酯婧籀肄捷陕浼砍石倪剖馊冱珥踣龆拥肆鸣遨呤巍茚悭枧氓黥骅动痪旨羊谷砰锓限篇厉醑睛侵靥卸筑推战钲琳霾罹橐噩胃材虱酪撬昶皑毗佣氛谦罴掴岸侏啄拼换畹渖侈缢骋瘛蓓溧询貉蔚雅嘈娃褓跏坤饵仍柜井捆赍硖浇髭赂衬棼按江究景荡校跟眷蠡盐逼鱿蔓捷危停酗睬麂洙嫒镄玮蚤砉陀贲忖瓒酷锅静葱蹑烩醢椁帷漶报筷戊窨榀拜裰鬼燎夙梵亮癃牢媚蛹醛贶夜适贰碴庸绁熳艴聃帮儒胆剔钙孪憾堂猗鬈犹授哧阡趋攀酯敲搦双生时呋璺驷墓尝逑悯跣冲撕窿杖肆飘酷赧全犹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