2_顾其芳——志贺修订2012.10厦门.ppt.ppt

食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验标准的修订GB4789 5 2012 10 修订背景 1 任务来源受卫生部食品安全综合协调与卫生监督局委托 按照食品安全国家标准审评委员会的工作安排 对该标准进行修订 2 项目负责与协作单位本标准负责起草单位是上海市疾病预防控制中心协作单位 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所 河南CDC 江西CDC 江苏CIQ 广西CDC 3 完成情况在修订工作中共收集专家反馈意见120余条 采纳90 以上 条 形成标准的草案稿 送审稿 2011年11月在北京召开第一届食品安全国家标准审评委员会检验方法与规程分委员会 微生物工作组 第五次会议 提交 食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验 送审稿 委员审查通过了该标准 主要的肠道病原菌之一 引起人类细菌性痢疾尽管大量的分类学资料认为这类细菌应包括在大肠杆菌 E coli 内 但一些临床微生物学家往往仍当作一个独立的菌属来对待 伯杰手册 1984 中将其分为4个血清群 种 A群痢疾志贺氏菌 S dysenteriae B群福氏志贺氏菌 S flexneri C群鲍氏志贺氏菌 S boydii D群宋内氏志贺氏菌 S sonnei 这些菌群还可根据血清学再进一步分型 志贺氏菌 培养特性 志贺氏菌属于革兰氏阴性短杆菌 无芽孢 无荚膜 无鞭毛 不运动需氧或兼性厌氧 营养要求不高 能在普通培养基上生长能利用葡萄糖与其他碳水化合物 产酸不产气 除A群外 B C D群均能发酵甘露醇 除D群外 A C和D群均不发酵乳糖 D群具有鸟氨酸脱羧酶 对可疑的食品 包括在使用前需用手处理的或轻微加热的产品 且其酸度范围由PH5 5至6 5之间 一般来说 当食品中含有大量的大肠菌群 大肠杆菌与沙门氏菌时 同时即可疑含有志贺氏菌 现行GB T4789 5 2003标准不足处 1 采用的GN增菌肉汤 37 需氧培养 4小时后大肠菌的生长速度大大超过志贺氏菌 所以检测效果较差2 使用的分离平板SS对志贺1型有抑制3 检验方法与现行的其它国家的标准存在差异 修订原则 1 以原国标为基础 保持与原标准的连续性考虑基层单位方法的可操作性 对增菌步骤 培养条件尽可能简化 生化反应方面亦尽量沿用原标准中的方法2 与国际接轨的原则该标准的起草内容主要参考了国际标准组织ISO标准 部分参考采用了美国FDA NMKL等标准 3 与现有已颁布的新版国家标准协调统一参考了已颁布的2008版国标 在样品的前处理步骤 培养条件的选择 文字描述等方面尽量保持一致 修订依据 1 GB T4789 5 20032 国际标准化组织ISO21567 2004Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs HorizontalmethodfordetectionofShigellaspp 3 美国食品药品管理局FDABacteriologicalAnalyticalManual 8thEdition 2001年 Chapter6Shigella 4 北欧食品分析委员会NMKLTheNordiccommitteeonfoodanalysisNO 1511995shigellabacteriadetecyioninfoods5 卫生防疫检验 1979年3月第一版6 痢疾防治手册 2006年9月第一版 增菌 用志贺增菌肉汤使处于濒死状态的细菌恢复活力 选择性平板分离培养 XLD MAC 显色培养基 生化试验 可采用API20E或VITEK2 血清学鉴定 特异性诊断血清鉴定到种 志贺氏菌操作流程 检验方法 食品卫生微生物学志贺氏菌检验方法 GB T4789 5 2003 修改的内容 增菌部分志贺氏菌增菌液 新生霉素0 5 g mL 原国标 GNISO 志贺氏菌增菌液 新生霉素0 5 g mL FDA 志贺氏菌增菌液 新生霉素0 5 g mL和3 g mL NMKL 志贺氏菌增菌液 新生霉素0 5 g mL GN增菌液GramNegativeEnrichmentBroth配方 g L 胰蛋白胨20 0葡萄糖1 0磷酸二氢钾1 5磷酸氢二钾4 0甘露醇2 0枸橼酸钠5 0去氧胆酸钠0 5氯化钠5 0pH值7 0 0 1 25 原理 胰蛋白胨提供碳源 氮源 维生素和矿物质 葡萄糖和甘露醇提供糖类 枸缘酸钠和去氧胆酸钠抑制革兰氏阳性细菌 但不影响沙门氏菌和志贺氏菌的生长 磷酸二氢钾和磷酸氢二钾是缓冲剂 氯化钠维持均衡的渗透压 志贺氏菌增菌肉汤ShigiellaBroth 原理 胰蛋白胨提供氮源和生长因素 磷酸氢二钾和磷酸二氢钾为缓冲剂 氯化钠维持稳定的渗透压 葡萄糖为可发酵糖 培养条件 41 5 1 厌氧培养原国标 37 需氧培养ISO 41 5 厌氧培养FDA 42 除宋内其他志贺菌 和44 宋内 厌氧培养NMKL 42 厌氧培养 分离用平板原国标 HE或SS MAC或EMBISO MAC XLD HEFDA MACNMKL MAC XLD HE 验证实验 我们通过人工布菌 用宋内氏志贺氏菌ATCC9290 福氏志贺杆菌ATCC12022 痢疾志贺氏菌ATCC13313 鲍氏志贺氏菌ATCC8704的标准菌株制成混悬液然后分别用原国标方法和志贺氏增菌液42 厌氧培养做方法的检出限 实验结论 1 通过对五种不同染菌浓度0 1cfu g 0 5cfu g 1cfu g 5cfu g 10cfu g的样品测定 用GN增菌液需氧培养 宋内氏志贺菌的最低检出限为5cfu g 福氏志贺氏菌的最低检出限为5cfu g 痢疾志贺氏菌的最低检出限为10cfu g 鲍氏志贺氏菌的最低检出限为10cfu g 所以方法的检出限为5 20cfu 25g 2 用志贺氏增菌液厌氧培养 宋内氏志贺菌的最低检出限为0 5cfu g 福氏志贺氏菌的最低检出限为1cfu g 痢疾志贺氏菌的最低检出限为5cfu g 鲍氏志贺氏菌的最低检出限为1cfu g 所以方法的检出限为0 5 5cfu 25g 实验操作步骤 增菌培养 用志贺氏菌增菌液增菌 41 5 16h 20h厌氧培养 分离培养 取增菌后的志贺氏增菌肉汤分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色平板上 于36 1 培养20h 24h 观察各个平板上生长的菌落形态 若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察 则继续培养至48h再进行观察 菌落特征 MAC琼脂 无色至浅粉红色 半透明 光滑 湿润 圆形 边缘整齐或不齐 直径2 3mmXLD琼脂 粉红色至无色 半透明 光滑 湿润 圆形 边缘整齐或不齐 直径1 2mm R F志贺氏菌显色琼脂 白色 不透明 圆形 边缘不整齐 直径1mm 3mm 菌落周围琼脂颜色变为紫红色 三 生化试验 志显 1宋内氏典型菌落 XLD 2福氏典型菌落 志显 XLD XLD 3鲍氏典型菌落 志显 XLD 4痢疾典型菌落 志显 5熟肉制品中宋内的分离效果 R F志显 XLD 志显 6蔬菜制品中宋内分离效果 XLD 志显 7鲍氏在生肉中的分离效果 XLD 8熟肉制品中福氏的分离效果 志显 初步生化 选取平板上5个或5个以上可疑菌落接种TSI 葡萄糖半固体 营养琼脂斜面 36 1 培养20h 24h 观察结果 培养物中出现以下情况可以弃去a 在三糖铁琼脂斜面上蔓延生长b 发酵乳糖或蔗糖c 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的d 产气的e 产生硫化氢f 有动力的培养物 双管糖 H2S阳性就是纸条变黑反之不色H2S纸条为白色吲哚阳性就是纸条变红反之不变色吲哚纸条为黄色湿软感 志贺氏菌属四个群的生化特征 附加生化实验 由于某些不活泼的大肠埃希氏菌 anaerogenicE coli A D Alkalescens Disparbiotypes碱性 异型 菌的部分生化特征与志贺氏菌相似 并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集 因此前面生化实验符合志贺氏菌属生化特性的培养物还需另加葡萄糖铵 西蒙氏柠檬酸盐 粘液酸盐试验 36 培养24h 48h 志贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌 A D菌的生化特性区别见表3 西蒙氏柠檬酸盐实验葡萄糖铵实验粘液酸盐实验 挑取少量琼脂培养物接种 于36 1 培养4d 每天观察结果 阳性者斜面上有菌落生长 培养基从绿色转为蓝色 鉴别细菌能否利用铵盐作为唯一氮源并分解葡萄糖产酸 溴麝香草酚兰是指示剂 产酸时培养基由绿色变为黄色 细菌如能利用粘液酸盐 则可分解而产酸 使培养基中的溴麝香草酚兰呈黄色 阴性 1 2 阳性 3 1 2 3 阳性 阴性 阴性 阳性 生化鉴定 增加了API20E诊断试剂条和全自动细菌生化鉴定仪VITEK 血清学鉴定 1 抗原的准备志贺氏菌属没有动力 所以没有鞭毛抗原 抗原构造与分型 志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原 O 及表面抗原 K 组成 O抗原为糖脂蛋白复合物 可分为型特异性抗原和群特异性抗原 志贺氏菌分为4个群 48个血清型 包括亚型及变种 K抗原在志贺菌属分类上无意义 菌体 0 抗原1 型特异性抗原 化学组成为多糖 是光滑型菌株所含有的重要抗原 当菌株变为粗糙型时 此抗原也常随之消失 根据所含的型抗原不同 可将志贺菌属分为A B C D四个群及39个抗原型 2 群特异性抗原 为光滑型菌株的次要抗原 也是菌体抗原的一种 特异性较低 主要存在于B群 根据所含的群抗原不同 可将一些菌型分为多种亚型 表面抗原 K抗原 在新分离的某些菌株菌体表面含有此种抗原 不耐热 加热100 1小时即被破坏 具有此种抗原的菌株 可阻止菌体抗原与相应免疫血清发生凝集 2 凝集反应 菌痢的流行型别变迁史1950 20世纪40年代以前 A群是主要的流行菌 60年代消声灭迹 1969 1970年在中美地区暴发 1972 1978年又在南亚地区流行 国内从90年代后期鲜有报道 偶有暴发 B群一直是国内的优势群 有资料表明 北京地区从1950 1989年 F1a和F2a一直是主要的交替流行菌株 其中1986年以5型 y变种 1988 1989年以F2a 3a为主 上海宝山区1990 2000年一直以F2a为主 2001年以宋内为主 2002 2003年又以F2b为主 2004年至今一直是F4c为流行菌型 2005年上海市菌痢型别分析 3 血清学分型 选做项目 先用四种志贺氏菌多价血清检查 如果呈现凝集 则再用相应各群多价血清分别试验 先用B群福氏志贺氏菌多价血清进行实验 如呈现凝集 再用其群和型因子血清分别检查 福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原鉴别见表4 如果B群多价血清不凝集 则用D群宋内氏志贺氏菌血清进行实验 如呈现凝集 则用其 相和 相血清检查 如果B D群多价血清都不凝集 则用A群痢疾志贺氏菌多价血清及1 12各型因子血清检查 如果上述三种多价血清都不凝集 可用C群鲍氏志贺氏菌多价检查 并进一步用1 18各型因子血清检查 志贺氏菌的O抗原 人们原来的认识认为血清学试验是特异性的 但是志贺氏菌的O抗原和大肠埃希氏菌属关系密切 有半数的菌型与大肠埃希氏菌的某些O抗原完全相同 相同抗原菌属间存在血清交叉凝集反应 因此 生化试验对于属的鉴定是非常重要的 志贺氏菌属与大肠埃希氏菌的O抗原关系 O抗原完全相同的 O抗原部分相同的 志贺氏菌属大肠埃希氏菌志贺氏菌属大肠埃希氏菌A2 112acA11 120 A3 124A2149A43588 51A3164 A558A488 159 A12 3341 55 152A6130B2b147abA7121B3a5444