第18章高效液相色谱法分析化学课件.ppt

第18章 高效液相色谱法 高效液相色谱法 highperformanceliquidchromatography HPLC 是在经典液相色谱法的基础上 引入了气相色谱的理论与高压技术 以高压输送流动相 采用高效固定相及高灵敏度检测器 发展而成的现代液相色谱分离分析方法 概述高效液相色谱 HPLC 是以溶剂液体为流动相的色谱方法 早期液相色谱 包括Tswett的工作 都是在直径1 5cm 长50 500cm的玻璃柱中进行的 为保证有一定的柱流速 填充的固定相颗粒直径多在150 200 m范围内 即使这样 流速仍然很低 1mL min 分析时间仍然很长 当加压增加流速 真空或空气泵 时 尽管分析时间减少 但柱塔板高度Hmin也相应增加了 或者说柱效下降了 为了解决分析时间及柱效问题 人们认识到 最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径 3 10 m 直到60年代 由于在高压下操作的液压设备 高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展 才彻底解决了分析时间及柱效的问题 即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用 HPLC与经典LC区别 HPLC与经典LC区别 主要区别 固定相差别 输液设备和检测手段 HPLC与GC差别 相同 兼具分离和分析功能 均可以在线检测主要差别 分析对象的差别和流动相的差别 1 分析对象GC 能气化 热稳定性好 且沸点较低的样品 高沸点 挥发性差 热稳定性差 离子型及高聚物的样品不可检测占有机物的20 HPLC 溶解后能制成溶液的样品 不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大 难气化 热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛 占有机物的80 2 流动相差别GC 流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力 只与固定相作用HPLC 流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力 为提高柱的选择性 改善分离度增加了因素 对分离起很大作用流动相种类较多 选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性 3 操作条件差别GC 加温操作HPLC 室温 高压 液体粘度大 峰展宽小 HPLC的特点和应用 三高 一快 一广 高柱效 远高于一般LC高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广泛 可分析80 有机化合物 第一节高效液相色谱法的主要类型与原理 一主要类型 四类基本类型色谱法分配色谱法 partitionchromatography 吸附色谱法 adsorptionchromatography 离子交换色谱法 IEC 空间排阻色谱法 SEC 化学键合相色谱法 将固定液的官能团键合在载体的表面 而构成化学键合相 以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法 简称键合相色谱法 BPC 二化学键合相色谱法 一 正相键合色谱法 1 分离机制 分配过程 组分在两相间进行分配 极性强的组分分配系数大吸附过程 溶质分子与固定相之间定向作用力诱导力 或氢键作用力2 固定相 极性大的氰基或氨基键合相3 流动相 极性小 同LSC 底剂 有机极性调节剂例 正己烷 氯仿 甲醇 氯仿 乙醇 4 流动相极性与k的关系 流动相极性 洗脱能力 组分tR k 5 出柱顺序 结构相近组分 极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱 6 适用 分析极性大物质 糖类等 二 反相键合相色谱 1 分离机制 疏溶剂理论把非极性的烷基键合相 看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的 分子毛 这种 分子毛 有强的疏水特性 当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时 一方面 非极性组分分子或组分分子的非极性部分 由于疏溶剂的作用 将会从水中被 挤 出来 与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用 另一方面 被分离物的极性部分受到极性流动相的作用 使它离开固定相 减少保留值 此即解缔过程 这两种作用力之差 决定了分子在色谱中的保留行为 保留机制疏溶剂理论 solvophobictheory 溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力 促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合 不是溶质分子与键合相间的色散力 2 固定相 极性小的烷基键合相C8柱 C18柱 ODS柱 3 流动相 极性大的甲醇 水或乙腈 水流动相极性 固定相极性底剂 有机调节剂 极性调节剂 例 水 甲醇 乙腈 THF 4 保留行为的影响因素 1 溶质的分子结构 溶质极性 疏水性 k 组分tR 2 流动相极性与k的关系 流动相极性 洗脱能力 k 组分tR 3 固定相 碳链 疏水性 k 组分tR 5 出柱顺序 极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱6 适用 非极性 中等极性组分 HPLC80 问题 正相和反相键合色谱法 在HPLC分析中 有时要在流动相中加入适量的盐 碳酸铵 四烷基铵盐 或酸 为什么 答 都是为了防止峰形拖尾 加入盐类是为了减少待测物与键合相表面的残留硅醇基作用 加入酸是抑制酸类待测物的离解 使其以游离酸在柱内分离 三 反相离子对色谱法 离子对色谱法 PIC 可分为正相与反相离子对色谱法 前者已很少用 反相离子对色谱法是把离子对试剂加入极性流动相中 被分析的样品离子在流动相中与离子对试剂的反离子生成不荷电的中性离子对 从而增加了样品离子在非极性固定相中的溶解度 使分配系数增加 改善分高效果 1 分离机制离子对模型 非极性或弱极性 2 影响容量因子的因素1 离子对试剂的种类分析碱类或带负电荷物质 用烷基磺酸盐或硫酸盐分析酸类或带正电荷物质 用四丁基季铵盐2 离子对试剂浓度 k tR 3 与R的链长有关 R 极性 k tR 4 流动相的pH对弱酸弱碱影响大 对强酸强碱影响小试样离解程度 越有利于离子对的形成 k 3 用途适用于有机酸 碱 盐的分离 以及用离子交换色谱法无法分离的离子型和非离子型化合物的混合物的分离 可以避免用普通的HPLC仪器长期进行IEC时 流动相 酸 碱 对泵与流路的腐蚀 此法在药物分析中应用很广 四 离子抑制色谱法在反相色谱法中 通过调节流动相的pH值 抑制样品组分的解离 增加它在固定相中的溶解度 以达到分离有机弱酸 弱碱的目的 称为离子抑制色谱法 ISC 1 离子抑制剂 弱酸 弱碱性物质pH一定的缓冲溶液 2 k的影响因素 与流动相极性有关 还与pH值有关选择流动相 应同时考虑极性及pH值酸性物质 加入酸HActR k 碱性物质 加入碱NH3 H2OtR k 调节pH范围 3 0 8 0pH 8 0破坏键合相与载体的结合pH 3 0腐蚀柱子3 适用 极弱酸碱物质pH 3 7弱酸 pH 7 8弱碱 两性化合物 一 离子色谱法离子色谱 IC 是70年代发展的新方法 其分离原理与离子交换色谱原理一样 只是流出的各种离子用电导检测器检测 但由于流动相都是强电解质 其电导率比待测离子约高2个数量级 这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号 为解决此问题 1975年Small提出 在离子交换柱之后 再串结一根抑制柱 该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂 通过分离柱后的样品再经过抑制柱 使具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相 从而可用电导检测器检测各种离子的含量 三其他高效液相色谱法 该法可以分析无机与有机阴 阳离子和氨基酸 以及糖类和DNA RNA的水解产物等 该法的不足之处在于 抑制柱要定期再生 谱峰在经过抑制柱后会展宽 降低分离度 因此有人提出了使用电导率很低的溶液 如苯甲酸盐稀溶液 作流动相 二 手性色谱法 用手性固定相或在流动相中加入手性添加剂 分离 分析立体异构体的方法 称为手性色谱法 CC 手性色谱法是分析与直接拆分对映体的重要手段 制备单一活性异构体 替代外消旋药物是当今制药业的发展趋势 手性固定相将起到重要作用 但由于手性色谱柱价格较贵 该法尚不普及 三 亲和色谱法 AC 原理 利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力 进行选择性分离 先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂 环氧 联胺等 再连接上配基 酶 抗原等 这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留 改变淋洗液后洗脱 第二节HPLC固定相和流动相及其选择 固定相 一化学键合固定相 化学键合固定相一般都采用硅胶 薄壳型或全多孔微粒型 为基体 在键合反应之前 要对硅胶进行酸洗 中和 干燥活化等处理 然后再使硅胶表面上的硅羟基与各种有机物或有机硅化合物起反应 制备化学键合固定相 按结构分 键合相可分为四种键型 1 硅酸酯型 Si O C 键合相 2 硅氮型 Si N 键合相 3 硅碳型 Si C 键合相 4 硅氧烷型 Si O Si C 键合相 按极性分 键合相可分为三种 1 非极性键合相 2 弱极性键合固定相 3 极性键合相 1 非极性键合相表面基团为非极性羟基 如十八烷基 C18 辛烷基 C8 甲基 C1 苯基等 常用于反相色谱非极性键合相的烷基链越长 稳定性越好 溶质的K越大 载样量越高 分离选择性越好 时间 min 固定相 C1 固定相 C8 固定相 C18 硅胶 烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1 尿嘧啶 2 苯酚 3 乙酰苯 4 硝基苯 5 苯甲酸甲酯 6 甲苯 可见 反相键合色谱中 键合相碳链越长 分离效果越好 2 弱极性键合固定相常见的有醚基和二羟基键合相可用于正相或反相色谱 3 极性键合相常用氨基 氰基键合相一般用于正相色谱 表示方法 国产 YWG C18H37YQG C18H37YWG CNYQG NH2YWG C6H5进口 SpherisorbODSLichrosorb CN 特点 1 不易流失2 热稳定性好3 化学性能好4 载样量大5 适于梯度洗脱使用时应注意 1 流动相pH应在2 8 否则会引起硅胶溶解2 不同厂家 不同批号的同一类型键合相也可能表现不同的色谱特性 二化学键合相色谱法的流动相理想的溶剂应有下列特性 与固定相不发生化学反应 对试样有适宜的溶解度 使k在1 10范围内 与检测器相适应 例如用紫外检测器时 选用截止波长小于检测波长的溶剂 对于折光率检测器 要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相 以达到最高灵敏度 4 高纯度 否则基线不稳或产生杂峰 同时可使截止波长增加 5 低的粘度 若使用高粘度溶剂 势必增高压力 不利于分离 常用的低粘度溶剂有丙酮 甲醇和乙腈等 但粘度过低的溶剂也不宜采用 例如戊烷和乙醚等 它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡 影响分离 一 流动相对分离的影响n由色谱柱 固定相 性能决定 主要受溶剂种类的影响 k受溶剂配比的影响 二 流动相的强度和选择性溶剂的极性 强度 正相色谱 溶剂极性越强 洗脱能力越强反相色谱 极性弱的溶剂洗脱能力强溶剂的选择性不同种类的溶剂 分子间的作用力不同 故选择性不同混合溶剂 二元或多元流动相 一 高效液相色谱中的速率理论vanDeemter方程 H A B u Cu1 涡流扩散项A 2 dpA与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子 有关 三 分离条件的选择 2 纵向扩散项B u纵向扩散项系数为B 2 Dm式中 弯曲因子 Dm 组分在流动相中的扩散系数Dm与流动相的粘度 成反比 与温度成正比 由于液体的粘度比气体大得多 约102倍 且在常温下操作 因此组分在液相中的扩散系数只有气体中的1 105 故在液相色谱中B可以忽略 3传质阻抗由三个系数组成 C Cs Cm CsmCs 固定相传质阻抗Cm 流动相传质阻抗Csm 静态流动相传质阻抗 GC中 固定液的传质阻抗起决定作用 C Cs 而HPLC中 固定液 是键合在载体表面固定液官能团的单分子层 厚度df可以忽略 因此 Cs可以忽略 1 固定相传质阻抗 2 流动相传质阻抗Cm由于在流路中心得流动相中的组分分子还来不及扩散进入流动相和固定相界面 就被流动相带走 因此总是比靠近填料颗粒与固定相达到分配平衡得分子移动得快些 从而使色谱峰变宽 Cm与固定相颗粒粒度dp得平方成正比 与组分分子在流动相中得扩散系数成反比 m是由柱和填充的性质决定的因子 3 静态流动相传质阻抗Csm由于固定相的多孔性 使部分流动相滞留在固定相微孔内 流动相要与固定相进行质量交换 必须先扩散到微孔内 如果固定相的微孔多 且又深又小 传质阻抗就大 使峰展宽就严重 Csm固定相颗粒粒度dp得平方成正比 与组分分子在流动相中得扩散系数成反比 sm与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关 H A Cmu Csmu原因 化学键合相 液体流动相 结果 HPLC的实验条件应该是 小粒度 均匀的球形化学键合相 低粘度流动相 流速不宜过快 柱温适当 HPLC中的速率理论 1 固定相 极性键合相氰基键合相 分离含双键的化合物氨基键合相 分离多官能团化学物如甾体 强心苷 糖类等2 流动相 烷烃 极性调节剂如正己烷 异丙醚 二 正相键合相色谱法的分离条件 三 反相键合相色谱法的分离条件 1 固定相 非极性键合相短链烷基键合相 分离极性化合物苯基键合相 分离芳香化合物和多羟基化合物ODS 分离各种类型的化合物2 流动相 水 极性调节剂 抑制剂极性调节剂 甲醇 乙腈抑制剂 弱酸 HAc 弱碱 NH3 缓冲液 磷酸盐 醋酸盐 四 反相离子对色谱法的分离条件 1 固定相 非极性键合相选用表面覆盖度高的键合相 C8 C182 流动相 极性溶剂 离子对试剂离子对试剂 季铵盐 分析酸类或带负电的物质烷基磺酸盐 硫酸盐 分析碱类或带正电荷的物质流动相pH 使试样组分与离子对试剂全部离子化有机溶剂 被测组分或离子对试剂的疏水性越强 需有机溶剂的比例越高 采用ODS柱为固定相 甲醇 水为流动相 用HPLC来分离两种弱碱性药物 pKa 8 9 但分离效果不理想 主要表现为柱效能低 保留时间过短 试设计通过改变流动相来提高分离效能的方案 10分 第三节高校液相色谱仪 流程 一高压输液系统1 贮液器 1 2L的玻璃瓶 配有溶剂过滤器 Ni合金 其孔很约2 m 可防止颗粒物进行泵内 2 脱气 超声波脱气或真空加热脱气 溶剂通过脱气器中的脱气膜 相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去 3 高压泵 对输液泵的要求 密封性好 输液流量稳定无脉动 可调范围宽 耐腐蚀 输液泵种类 恒压型和恒流型 恒压泵 类似于风箱 可迅速获得高压 适于柱的匀浆填充 但因泵腔体积大 在往复推动时 会引起脉动 且输出流量随色谱系统阻力 主要是柱填充物 变化而变化 现已较少使用 恒流型溶剂流量恒定 与柱填充情况无关 使用较多 有机械注射式和机械往复式两种 应用最多的是机械往复式恒流泵 见下图 每分钟往复25 100次 因此脉动小 对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰 此时可连接一脉动阻尼器 4 梯度淋洗装置 梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例 从而使流动相的强度 极性 pH值或离子强度相应地变化 达到提高分离效果 缩短分析时间的目的 如果只有一个泵 可采用低压混合设计 将两种或以上的溶剂按一定比例混合 再由高压泵输出 如果有两个或以上泵 调节各自的流量 在高压下混合 分离和进样系统 一 进样系统与GC相比 HPLC柱要短得多 因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些 即 HPLC的展宽多因一些柱外因素引起 这些因素包括 进样系统 连接管道及检测器的死体积 进样装置包括两种 1 隔膜注射进样 使用微量注射器进样 装置简单 死体积小 但进样量小且重现性差 2 高压进样阀 目前最常用的为六通阀 由于进样量可由样品管控制 因此进样准确 重复性好 如图 二 色谱柱由柱管与固定相组成 柱管多用不锈钢制成 管内壁要求具有很高的光洁度 固定相采用匀浆法高压 80 100MPa 装柱 色谱柱按规格不同分为分析型与制备型两类分析型柱常量柱 内径2 4 6mm 柱长10 25cm 半微量柱 内径1 1 5mm 柱长10 20cm实验室制备型柱 内径20 40mm 柱长10 30cm 色谱柱柱效的评价柱性能指标包括在一定条件下 试样 流动相 流速 温度 下的柱压 理论塔板高度H和理论塔板数n 对称因子f 容量因子k和选择性因子的重复性 或分离度R 分析样品时 需检验柱性能是否合乎要求 常用色谱柱柱效评价条件如下 硅胶柱样品 苯 萘 联苯及菲 用己烷配制 流动相 无水己烷 反相色谱柱 ODS柱等 样品 尿嘧啶 测死时间用 硝基苯 萘及芴 或甲醇配制的硅胶柱样品 流动相 甲醇 水 85 15 乙腈 水 60 4O 正相色谱柱 氰基与氨基柱等 样品 四氯乙烯 测死时间用 邻苯二甲酸二甲酯 邻苯二甲酸二正丁酯及肉桂醇 也可用偶氮苯 氧化偶氮苯及硝基苯为样品 流动相 正庚烷按上述条件 测得各组分的W1 2 及tR 求出理论塔板数n及相邻组分的分离度R l 5 色谱柱柱效指标填料粒径为3 m 4 m 5 m 7 m或10 m时 柱效应分别大于8万 6万 5万 4万及2 5万理论塔板数 米 或用m 1表示 色谱柱的再生反相色谱柱以甲醇一水 95 5 纯甲醇及一氯甲烷等为流动相 依次冲洗 顺序不得颠倒 每种流动相的冲洗体积应20倍于柱体积 然后 再以相反顺序依次冲洗 正相色谱柱 含硅胶柱 以严格脱水的正己烷 异丙醇 一氯甲烷及甲醇为流动相 依次冲洗 顺序不得颠倒 其它步骤同上 三 检测系统要求 灵敏度高 噪声低 线性范围宽 重复性好 适用性广等 应用最多的是紫外检测器 UVD 其次是荧光检测器 FD 与电化学检测器 ECD 示差折光检测器 RID 虽是泛用型检测器 因受温度影响较大 灵敏度不够高 除还用于糖类的检测外 已少用 新型蒸发光散射检测器及发光检测器是有发展前途的检测器 一 紫外检测器 UVD或UV HPLC分析中因此该类检测器应用很广 原理样品组分通过流通池时对特定波长紫外线的吸收与浓度成正比 检测系统由光源 流通池 检测元件 微机及记录器等组成 常用纯溶剂的截止波长 水190 乙腈190 甲醇205 正己烷210 乙醚220 四氢呋喃225 二氯甲烷245 氯仿245nm 在选择测量波长时注意 溶剂必须能让所选择的光透过 即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长 截止波长 特点 灵敏度高 噪音低 最小检出量可达10 12g 不破坏样品 能与其它检测器串联 对温度及流速波动不敏感 可用于梯度淋洗 属浓度型检测器 弱点 只能检测有紫外吸收的样品 流动相的选择有一定限制 紫外吸收检测器的类型分为 固定波长型 可变波长型及二极管阵列检测器三种 1 固定波长检测器是光源波长固定的光度计 一般波长为254nm 相当于定波长紫外光度计 因波长不能调节 不能选择在最佳吸收波长下检测 已基本淘汰 2 可变波长型检测器是一台紫外 可见分光光度计或紫外分光光度计 波长可按需要选择 是HPLC配置最多的检测器 其光学结构与一般紫外分光光度计一致 主要区别是用流通池替代了比色池 通常其光程为2 10mm 体积约为1 10 L 3 光电二极管阵列检测器 PDAD 是80年代出现的新型紫外检测器 人们想测定通过流通池时各组分的光谱获得定性信息 但因组分停留时间太短 1秒 普通紫外分光光度计的扫描速度跟不上 若停留扫描则破坏了分离状态 而二极管阵列检测器用二极管阵列代替光电管 一般一个二极管对应接受光谱上一个纳米 nm 谱带宽度的单色光 可在全波长范围进行快速扫描 获得三维光谱一色谱图 同时得到定性 定量信息 二 荧光检测器 FD 早期的荧光检测器是具有滤光片的荧光光度计 已基本淘汰 目前使用的荧光检测器多是具有流通池的荧光分光光度计 直角光路 检测限可达1 10 10g ml 比紫外检测器灵敏 但只适用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质 主要用于氨基酸 多环芳烃 维生素 甾体化合物 酶类 黄曲霉素 卟啉类化合物 农药等的检测 三 蒸发光散射 化学发光及安培检测器1 蒸发光散射检测器 ELSD 是90年代出现的最新型的泛用检测器 可用于挥发性低于流动相的任何样品组分的检测 主要用于糖类 高分子化合物 高级脂肪酸及甾体类等 还可用于凝胶色谱及超临界流体色谱的检测 原理 将流出色谱柱的流动相及组分先引入通载气 高纯N2 的蒸发室 加热 使流动相蒸发除去 组分则形成气溶胶 被载气带入检测室 用激光或强光照射气溶胶而产生散射光 丁锋尔光效应 测定散射光强而获得组分的浓度信号 散射光强I与进入检测器的气溶胶中组分质点的 质量和 m的关系为 I kmbk b是二个与实验条件有关的常数 2 化学发光检测器是近年发展起来的高选择性 高灵敏度的新型检测器 设备简单 自身发光