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文档简介
4、单糖组成分析 样品的水解 所需试剂 TFA(三氟乙酸) 甲醇 NaBH4 乙酸 醋酐 吡啶 甲苯 氯仿取5mg多糖样品,置于5ml安培管中,加入2mol/L TFA4ml,在110下水解2h。水解完毕后,冷却,溶液于40减压浓缩加入3ml甲醇蒸干,重复操作4-5次以除尽TFA。将完全水解后的样品溶于3ml蒸馏水,加30mgNaBH4,室温下还原3h,期间震荡几次,然后用25%乙酸中和过量的NaBH4,至溶液不再产生气泡为止。PH应在4-5之间,加甲酸多次,减压蒸干以除去反应副产物及水分,至瓶壁上基本不附固体大颗粒为止,然后置于真空干燥器中过夜。次日,于110烘箱中加热15min,充分除去残留的水分后,加3-5ml醋酐和3ml吡啶,密塞,100下反应1h,冷却,加甲苯多次共蒸除去多余醋酐,真空干燥。将乙酰化产物用适量氯仿溶解,经等体积蒸馏水洗涤次,无水硫酸钠干燥,浓缩至小体积(约0.1ml)后直接进行气相色谱分析。 GC(气相色谱)条件载气N2流速20mlmin,H2流速30mlmin,空气流速200mlmin;柱温230,检测器温度250,气化室温度280。5、糖残基连接方式的确定所需试剂 DMSO NaOH 碘甲烷 氮气 乙酸 甲酸 甲醇 三氟乙酸 NaBH45.1 甲基化 将样品置于干燥器中80处理5h以上,然后置于含有P2O5的真空干燥器中过夜。分别取18mg干燥后的多糖置于甲基化反应瓶中,加入4ml干燥的DMSO后超声处理30min使样品完全溶解,然后快速加入20mg预先干燥的NaOH粉末,超声2h使NaOH粉末完全溶解,冰浴甲基化反应瓶5min至反应完全冻结。取出反应瓶,用移液管分别缓慢加入0.6ml干燥的碘甲烷至冻结的反应完全溶解,充入氮气,再分别超声处理反应液1h。然后分别加入1ml蒸馏水至反应瓶中使甲基化反应结束。再加入1molL的乙酸中和反应液。流水透析至反应液颜色转为无色,冷冻干燥,红外检测多糖羟基是否完全甲基化,若没有则需重复上述操作。5.2 样品的水解 将完全甲基化的多糖样品分别溶于4ml 90的甲酸溶液,密塞后于110烘箱中解聚6h。反应结束后减压蒸干,分别加3ml甲醇重复蒸干4次,以除去过量甲酸。然后将蒸干后的解聚样品加入4ml 2mol/L三氟乙酸的安培管中,封管后110水解2h后减压蒸干,重复加甲酸多次蒸干以除去过量的三氟乙酸。再加入3ml蒸馏水充分使样品溶解。30mg NaBH4还原乙酰化后制得部分甲基化的乙酸衍生物,氯仿-水体系萃取衍生物,回收氯仿层,减压浓缩至约0.1ml后进行GC-MS分析。 5.3 GC-MS分析 设定好GC/MS操作参数, GC-MS测试条件为:毛细管柱HP-5,程序升温50-250,10min,进样口温度260;离子源:EI;氦气流速1ml/min.。当系统提示可以进样时,使用10 L进样针准确吸取5 L样品溶液(不能有气泡)加入到进样口,分析开始。对得
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