饲料中粗蛋白的测定.doc

饲料中粗蛋白的测定-定氮仪法参照GB/T 6432941 适用范围本方法适用于配合饲料、浓缩饲料及单一饲料。2 测定原理在催化剂（如硫酸铜、硫酸钾、硫酸钠或硒粉）作用下，试样中有机物质被浓硫酸消化分解，使含氮物质（蛋白质，氨态氮等）转化为硫酸铵，而非含氮物质则以二氧化碳、水蒸气、二氧化硫等气态逸出。消化液在强碱作用下蒸馏，释放出氨气，氨气冷凝后被硼酸吸收，并与其结合成硼酸铵，然后以甲基红-溴甲酚绿作混合指示剂，用盐酸标准滴定溶液滴定，求出氮的含量，再乘以一定的换算系数（通常用6.25计算），即得出试样中粗蛋白质的含量。3 试剂和材料未特殊标注的试剂均为分析纯。水至少应为GB/T 6682-1992规定的3级3.1 浓硫酸：化学纯。3.2 400g/L氢氧化钠溶液：400 g氢氧化钠(化学纯)，溶于1000 mL水中。3.3 混合催化剂：取质量比为1:9的五水合硫酸铜(预处理：研磨至粉末状)和无水硫酸钾混合并研磨混匀，装入试剂瓶中密封备用。3.4 1 g/L甲基红乙醇溶液：称取0.10g甲基红溶于100 mL乙醇中，棕色瓶中保存3个月。3.5 1 g/L溴甲酚绿乙醇溶液：称取0.10g溴甲酚绿溶于100 mL乙醇中，棕色瓶中保存3个月。3.6 硼酸吸收液：称取40 g硼酸溶于1 L水中，缓慢加热搅拌溶解，注意加热时不能将溶液加热沸腾，加入溴甲酚绿乙醇溶液（1 g/L）10 ml和甲基红乙醇溶液（1 g/L）6.8 mL，充分混匀。 向其中加入2%的氢氧化钠溶液，直到达到以下要求：取30mL上液于锥形瓶中，加入100 mL水，观察溶液颜色，应为接近盐酸滴定终点的暗灰绿色，以利于蛋白测定中空白的滴定（每10升硼酸溶液约加2%的氢氧化钠溶液3.8mL）。混合均匀后置阴凉处保存，保存期为1个月。3.7 0.1 mol/L或0.05mol/L盐酸标准滴定溶液：8.3 ml（或4.15ml）盐酸注入1000 mL水中，用无水碳酸钠法标定。3.8 蔗糖：分析纯。3.9 硫酸铵：基准试剂。4 仪器设备4.1 实验室用粉碎机。4.2 分样筛：40目（孔径0.42 mm）。4.3 分析天平：感量 0.0001 g。4.4 消煮炉。4.5 凯氏定氮仪：FOSS Kjeltec 8100。5 试样的选取和制备按中慧农牧股份有限公司近红外仪作业指导书中“样品制备”项制备样品，密封保存，防止试样中组分变化或变质。6 分析步骤6.1 采用福斯公司消煮炉及Kjeltec 8100凯氏定氮仪的分析步骤6.1.1 试样的消煮按表1准确称取相应重量的试样(含氮量20-40 mg)，放入消化管中，加入5 g混合催化剂及10 mL硫酸，浸泡15 min后将其放在消化炉上，打开冷凝水，在工作温度为420oC下的消煮炉上消化一小时二十分钟(至消化管内液体呈蓝绿色且澄清)，关闭消化炉，继续通冷凝水至消化管中基本无气体放出。缓慢冷却至室温，防止消化管内骤冷结晶。表1 不同蛋白含量样品称量及滴定规定蛋白含量（%）称样量（g）盐酸浓度（mol/L）滴定管（ml）样品品种50.60.0225乳清粉5-100.70.0525玉米10-150.550.0525米糠、面粉、小麦、麸皮、次粉、549F、00615-200.50.0525米糠粕、玉米胚芽粕、成品20-300.6-0.80.150酒糟、柠檬酸渣、30-400.5-0.60.150浓缩料、菜粕、膨化大豆40-500.35-0.60.150豆粕、蛋白饲料、花生粕、肉骨粉、棉粕、棉籽蛋白50-600.3-0.350.150鱼粉、玉米蛋白粉60-800.25-0.30.150鱼粉、羽毛粉、生物蛋白6.1.2 氨的蒸馏及吸收打开福斯凯氏定氮仪，接通冷凝水，检查碱桶及蒸馏水桶中液面位置，如不足应及时添加。先选择清洗程序(程序3)将仪器清洗两次，然后选择空白程序(程序)做3个仪器空白。空白及试样的蒸馏操作过程如下：取30 mL硼酸吸收液加入到250 mL锥形瓶中，将蒸馏装置的冷凝管末端浸入锥形瓶中硼酸吸收液液面以下。将冷却至室温的消煮管插在蒸馏装置上，然后选择程序1运行，此时仪器自动进水50 mL，进碱液50 mL，然后开始蒸馏，要注意观察仪器运行，如显示“消化管未就位”，则应立刻终止程序，进行手动操作。蒸馏结束后仪器自动停止运行。此时应先取下消化管，用蒸馏水冲洗进气管，将黑色废液倒入特定桶中；再取下硼酸锥形瓶，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内。然后放入另一装有30 mL硼酸吸收液的锥形瓶，插入另一装有消化后试样的消煮管，重复上述操作。注意所有试样蒸馏结束后应选择清洗程序，对仪器进行两次清洗。6.1.3 滴定用0.1mol/L或0.05mol/L盐酸标准工作溶液滴定吸收液，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。6.1.4 空白测定取蔗糖0.5g代替试样，按6.1.1、6.1.2、6.1.3进行空白测定，消耗盐酸标准溶液的体积不得超过0.2 mL。6.1.5 蒸馏步骤的检验准确称取0.2g硫酸铵，代替试样，按6.1.2、6.1.3步骤进行操作，测得硫酸铵含氮量为21.19%0.2%，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。7 计算试样中粗蛋白含量以质量分数表示，数值以%计，按下式进行计算：式中：V2试样滴定时消耗标准盐酸量，mL；V1空白滴定时消耗标准盐酸量，mL；c盐酸标准溶液的浓度，mol/L；m试样质量，g；0.014每毫升1mol/L的HCl标准溶液相当于氮的克数；6.25氮换算成蛋白质的平均系数。8 重复性每个样品取两个平行样进行测定，取其算术平均值，两次滴定用标准液之差不超过0.1ml。粗蛋白%25%时，允许相对偏差为1%；10%粗蛋白%25时，允许相对偏差为2%；粗蛋白%10%时，允许相对偏差为3%。9 注意事项9.1 平行测定试样时称样量要尽量一致，以减少误差；称样量要适当，保证滴定时消耗盐酸标准液的体积数不少于15ml。9.2 样品要用称量纸包裹好后放入消化管中，催化剂要称量在5.0g左右。缓缓加入硫酸，浸泡样品15 min后将其放在消化炉上。9.3 消化炉温在200以下时才可以将盛有样品的消化管放在消化炉上开始消化。9.4 试样消化初期应保证冷凝水流量足已带走实验所产生的有毒有害气体，待消化液成澄清的蓝绿色时调小冷凝水流量。9.5 消化后的试样溶液在放置冷却后会结晶成固体，若结晶成固体后应在电炉上加热溶解后再进行蒸馏操作，否则会在通入蒸汽时反应剧烈，内部压力增高，有试样溶液逸出或炸裂消化管的可能。9.6 重新配制盐酸标准溶液后要进行蒸馏器硫酸铵回收率的化学检验。9.7 定氮仪开机之后蒸馏试样溶液之前需要进行一次无样测试（清洗），清洗仪器内部管路，排除仪器内部管路的残存的气体；蒸馏结束后同样需要进行一次无样测试（清洗），清洗仪器内部管路。蒸馏过程中长时间使用高浓度的氢氧化钠溶液，在管路内部会形成氢氧化钠固体结晶，轻者加氢氧化钠量不足，严重的会造成