药学专业毕业设计_采用高效液相色谱法测定当归苦参丸.doc

中南大学药学专业自考本科生毕业论文 考 籍 号 学生姓名 指导教师 年 级 2005级 论文题目 采用高效液相色谱法测定当归苦参丸中苦参碱及氧化苦参碱的含量完成时间 2006年12月 1、 论文正文：包括题目、学生姓名、指导教师姓名、中文摘要（或英文摘要）及关键词、论文正文、参考文献。2、湖南省高等教育自学考试毕业论文（设计）情况登记表湖南省高等教育自学考试毕业论文（设计）情况登记表 考 籍 号 姓 名 专 业 药 学 题 目 采用高效液相色谱法测定当归苦参丸中苦参碱及氧化苦参碱的含量通讯地址 湖南怀化红星中路49号邮政编码 418000 湖 南 省 教 育 考 试 院 制填 表 说 明一、内容提要栏，由考生本人填写。二、毕业论文（设计）成绩评定，根据专业特点，分项评定，每个项目的分数标准由考生所在系确定。总计后按五级记分制（90分以上为优秀，8089分为良好，7079分为中等，6069分为及格，60分以下为不及格）记入成绩评定栏内。三、一律用蓝色或和黑色墨水的钢笔填写，字迹要清楚，内容要简明。采用高效液相色谱法测定当归苦参丸中苦参碱及氧化苦参碱的含量一、实验材料1. 样品来源：当归苦参丸由湖南汉森制药有限公司提供，批号：05105，051206，0512072. 仪器与试剂：仪器：Mettler AE-240电子天平 超声波清洗仪 CG-300(300W，25KHz)重蒸馏水(自制)；乙腈（色谱纯），浙江临海市浙东特种化学试剂厂其余试剂均为分析纯苦参碱对照品 中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，批号：110805-200306氧化苦参碱对照品 中国药品生物制品检定所提供，批号：110780-200405，供含量测定用二、试验方法 【含量测定】采用高效液相色谱法测定苦参中的苦参碱和氧化苦参碱的总量。建立了本品的含量测定方法，并进行了方法学考察，经试验结果表明，该方法检测灵敏度、准确度高，操作简便，缺苦参的阴性溶液无干扰，且样品分离效果好。采用HPLC法测定三批苦参药材的含量。参考中国药典2005年版苦参“本品含苦参碱和氧化苦参碱不得少于1.2%”，暂规定本品每丸含苦参以苦参碱和氧化苦参碱的总量计，不得少于20.0mg。方法学考察结果如下：1、检测波长的选择精密称取苦参碱4.59mg和氧化苦参碱5.12mg，分别置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液，照紫外分光光度法（中国药典2005年版一部附录A）于200390nm波长范围内扫描。结果表明：苦参碱和氧化苦参碱溶液均在208nm波长处有最大吸收，故选择208nm波长为检测波长，见附图。 图1苦参碱对照品溶液紫外扫描图图2氧化苦参碱对照品溶液紫外扫描图2、仪器仪器： Agilent 1100system 高效液相色谱仪；A09.03色谱工作站3、色谱条件色谱柱： Phenemonex C18 (2504.6mm，5m)流动相：乙腈0.1三氟醋酸（5:95）流速：1.0ml/min检测波长：208nm柱温：354、对照品溶液的制备：取苦参碱和氧化苦参碱对照品，经五氧化二磷减压干燥12小时，各精密称取适量，加10%乙醇制成每1中含苦参碱0.0512mg、氧化苦参碱0.1924mg的混合对照品溶液。5、供试品溶液与阴性溶液的制备5.1 提取溶剂的选择取本品（05105批），剪碎，取约0.3g，精密称定，置25ml量瓶中，分别按表1中所列溶剂加入20ml，超声处理10分钟使溶散，放置过夜，超声处理30分钟，放冷，用各溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按上述色谱条件，精密吸取对照品溶液3l及供试品溶液各15l，注入液相色谱仪，测定，结果见表1。表1提取溶剂比较表编号提取溶剂测定结果（mg/丸）编号提取溶剂测定结果（mg/丸）1水43.9450%乙醇34.5210%乙醇45.9570%乙醇20.1330%乙醇41.36乙醇不能溶散结果表明：以10乙醇为提取溶剂的得率高，故选择10%乙醇为提取溶剂。5.2 提取时间的考察 取本品（05105批），剪碎，取约0.3g，精密称定，置25ml量瓶中，加10%乙醇20ml，超声处理10分钟使溶散，浸渍1小时，分别超声处理60、90分钟，放冷，用10%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按上述色谱条件，精密吸取供试品溶液各15l，注入液相色谱仪，测定，结果见表2。表2 不同提取时间的含量测定结果比较表提取时间（分钟） 6090测定结果（mg/丸）48.7747.98结果表明：提取60分钟即可。综合比较表1、2的结果，供试品溶液的制备为：取本品适量，剪碎，取约0.4，精密称定，置25ml量瓶中，加入10乙醇20ml，超声处理10分钟使溶散，浸渍1小时，超声处理1小时，放冷，加10乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。阴性溶液的制备：按【处方】取相当于0.4g样品的除苦参以外的其余药材，按【制法】制备阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成苦参的阴性对照溶液。6、测定法分别精密吸取对照品溶液3l、阴性对照溶液与供试品溶液各15l，注入液相色谱仪，测定，即得。在选定的色谱条件下，经HPLC法测定苦参碱、氧化苦参碱与样品中其它组份峰可达基线分离，且与其它相邻峰分离度均大于1.5，理论板数按氧化苦参碱峰计，不低于5000，缺苦参的阴性对照色谱在与苦参碱、氧化苦参碱对照品色谱峰相应位置上无干扰峰，见附图。图3当归苦参丸的阴性样品HPLC色谱图图4当归苦参丸的对照品HPLC色谱图（RT 9.1：苦参碱；RT 15.4:氧化苦参碱）图4当归苦参丸的供试品HPLC色谱图 7、线性关系考察 精密吸取上述混合对照品溶液1、2、3、4、5、7l进样，测定其峰面积积分值，以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程分别为：苦参碱 Y1771.893X-0.452，r0.9990；氧化苦参碱 Y1773.376X-59.279，r0.9999；结果表明苦参碱在0.05120.3584g范围内、氧化苦参碱在0.19241.3468g范围内具有良好的线性关系。数据见表3、4。表3 苦参碱线性关系考察结果表进样量（）0.0512 0.1024 0.1536 0.2048 0.256 0.3584峰面积值96.81795 184.89871 267.17508 355.56 443.10406 645.58759表4 氧化苦参碱线性关系考察结果表进样量（） 0.1924 0.3848 0.5772 0.7696 0.962 1.3468峰面积值 280.44098 626.34058 964.74255 1306.04895 1641.415 2331.684818、精密度试验精密吸取同一供试品（05105批）溶液15l，重复进样5次，测定苦参碱、氧化苦参碱峰面积积分值，其结果见表5、6。表5 精密度试验结果表（苦参碱）峰面积积分值 440.60858 445.35721 454.64105 458.10077 444.65549 RSD（%） 1.64 表6 精密度试验结果表（氧化苦参碱）峰面积积分值 1816.77625 1809.29102 1812.80054 1816.89087 1839.06165 RSD（%） 0.64 结果表明：该方法精密度好。9、稳定性试验分别精密吸取同一供试品（05105批）溶液15l，于0、3、5、10、15小时进样，测定苦参碱、氧化苦参碱峰面积积分值，结果见表7、8。表7 稳定性试验结果表（苦参碱）峰面积积分值 440.60858 454.64105 444.65549 436.34662 435.54675 RSD（%） 1.75 表8 稳定性试验结果表（氧化苦参碱）峰面积积分值 1816.77625 1812.80054 1839.06165 1816.9762 1842.13965 RSD（%） 0.76 结果表明，供试品溶液在配制后的16小时内基本稳定。10、重复性试验取同一批号样品（05105批），按上述含量测定项下的方法，分别取5份样，依法制备供试品溶液，依法测定并计算，结果见表9。表9 重复性试验结果表编号12345平均RSD(%)苦参碱含量（mg/丸）8.999.178.979.169.049.061.03氧化苦参碱含量（mg/丸）38.638.4639.6738.9339.3039.01.27总量（mg/丸）47.5947.6348.6448.0948.3448.060.94结果表明：本法重复性好。11、回收率试验取已知含量的本品（05105批，每g含苦参碱0.9963mg、氧化苦参碱4.2846mg），剪碎，取约0.2g，置25ml量瓶中，精密称定，精密加入苦参碱对照品溶液 (0.0483mg/ml)和氧化苦参碱对照品溶液（0.3328mg/ml）各3l，各加入10%乙醇14ml，按上述含量测定项下的方法测定含量，结果见表10、11。表10 苦参碱回收率测定结果表编 取样量 样品中苦参 加入苦参 实测总 回收率 平均回收 号 (g) 碱含量(mg) 碱量(mg) 量(mg) （%） 率（%） RSD(%) 1 0.2003 0.1995 0.3444100.00 2 0.2002 0.1995 0.3394 96.54 3 0.2032 0.2024 0.1449 0.3478100.34 98.73 1.91 4 0.18500.1834 0.325697.51 5 0.20110.2003 0.3465100.89 6 0.1902 0.1894 0.3301 97.10表11 氧化苦参碱回收率测定结果表编 取样量 样品中苦参 加入苦参 实测总 回收率 平均回收 号 (g) 碱含量(mg) 碱量(mg) 量(mg) （%） 率（%） RSD(%) 1 0.2003 0.8582 1.856599.98 2 0.2002 0.8577 1.8590 100.29 3 0.2032 0.8706 0.9984 1.852398.32 100.14 1.96 4 0.18500.7926 1.8292103.82 5 0.20110.8616 1.845998.58 6 0.1902 0.8149 1.8118 99.85结果表明，本方法加样回收率好。11、成品与药材含量测定结果11.1 三批成品含量测定结果按拟定的含量测定方法测定三批成品中苦参碱和氧化苦参碱的总量，结果见表12。表12 样品含量测定结果表批号051205051206051207测定值 （mg/丸）47.848.348.1参照中国药典2005年版一部苦参的含量限度，暂规定本品限度为每丸含苦参以苦参碱和氧化苦参碱的总量计，不得少于25.0mg。三批样品均符合规定。11.2 药材含量测定取苦参药材粉末（过二号筛），取约0.2g，精密称定，置50ml量瓶中，加入10乙醇40ml，超声处理10分钟，浸渍1小时，超声处理1小时，放冷，加10乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按成品的含量测定方法测定，结果见表12。表12 苦参药材含量测定结果表批号1号2号3号测定值 （）2.92.72.6参考文献：1 中国药典2005年版一部毕业论文（设计）分项成绩项次分 项 内 容分数标准实得分数1基础理论与专业知识的掌握情