SHMT基因工程菌的构建方案.doc

SHMT基因工程菌的构建第四组一、实验相关知识1、丝氨酸羟甲基转移酶是丝氨酸合成中的关键酶，能催化甘氨酸和丝氨酸的相互转化，具体的催化反应如下：SHMT甘氨酸+N5,N10-亚甲基四氢叶酸 L-丝氨酸+四氢叶酸在丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）作用下，甘氨酸同亚甲基四氢叶酸反应生成L-丝氨酸。该反应需要5-磷酸吡哆醛作为辅酶。N5,N10-亚甲基四氢叶酸上亚甲基可以来自于甘氨酸、甲醛、甲酸、蛋氨酸、胆碱和肌氨酸，它们同四氢叶酸反应生成N5,N10-亚甲基四氢叶酸。本实验以甘氨酸和甲醇为前体物发酵生产L-丝氨酸时，菌体积累L-丝氨酸与菌体含有的SHMT的活性直接相关，但由于SHMT的催化作用理论上是双向的，有必要了解在相同的培养条件或者在本文所用的菌株SHMT是否具有双向催化作用。2、基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。所谓基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。3、丝氨酸是一种非必需氨基酸，它在脂肪和脂肪酸的新陈代谢及肌肉的生长中发挥着作用，因为它有助于免疫血球素和抗体的产生，维持健康的免疫系统也需要丝氨酸。丝氨酸在细胞膜的制造加工、肌肉组织和包围神经细胞的鞘的合成中都发挥着作用。大肠杆菌细菌染色体DNA的制备（预习方案）一 实训目的.学习并掌握细菌基因组的基本知识和提取方法二 实训原理及相关知识1. 大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli） 革兰氏阴性短杆菌，大小0.513微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，几占粪便干重的1/3。国家规定，每升饮用水中大肠杆菌数不应超过3个大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。2. 大肠杆菌常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎等等。侵入人体一些部位时，可引起感染，如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。人在感染大肠杆菌后的症状为胃痛、呕吐、腹泻和发热。感染可能是致命性的，尤其是对孩子及老人。3. 大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核；细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。4. 大肠杆菌在生物技术中的应用：大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。5. 核酸：核酸DNARNA名称脱氧核糖核酸核糖核酸结构规则的双螺旋结构通常呈单链结构基本单位脱氧核糖核苷酸核糖核苷酸五碳糖脱氧核糖核糖含氮碱基A、G、C、TA、G、C、U分布主要存在于细胞核，少量存在于线粒体和叶绿体主要存在于细胞质主要功能携带遗传信息，在生物体的遗传、变异和蛋白质的生物合成中具有极其重要的作用作为遗传物质：只在RNA病毒中；不作为遗传物质：在DNA控制蛋白质合成过程中起作用。mRNA是蛋白质是合成的直接模板、tRNA能携带特定氨基酸、rRNA是核糖体的组成成分；催化作用：酶的一种6.7. 基因组是指细胞或生物体中，一套完整单倍体的遗传物质的总和，或原核生物染色体、质粒、真核生物的单倍染色体组、细胞器、病毒中所含有的一整套基因。8. 实训原理提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。三 实训试剂 LB液体培养基，LB固体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/L NaCl， CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇四 仪器设备超净台、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、恒温摇床、台式高速冷冻离心机、恒温水浴锅、循环水真空泵、电子天平、冰箱、精密pH试纸、微量移液器、离心管、试剂平、tip头、吸水纸、标签纸、记号笔等。五 实训步骤1. 菌种培养固体培养基：从活化的大肠杆菌斜面上挑取少量菌种，接种到一只新鲜的LB固体平板上，倒置在恒温培养箱中，37度培养1618h。液体培养基：从活化的大肠杆菌斜面上挑取少量菌种，接种到一只装有5ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，置于恒温摇床中，37度振荡培养过夜。2. 试剂的配置（1）、LB液体培养基：蛋白胨1.0g ，酵母膏0.5g ，NaCl1.0g ，加蒸馏水使之充分溶解，滴加5mol/LNaOH调pH至7.0 ，补足水分至100ml，121度高压蒸汽灭菌20min，冷却待用。（2）、LB固体培养基：蛋白胨1.0g ，酵母膏0.5g ，NaCl1.0g ，加蒸馏水使之充分溶解，再加琼脂粉1.5g ，加热融化，补足水分至100ml，调pH至7.0 ，121度高压蒸汽灭菌20min，冷却待用。（3）TE溶液：实验室所用的TE缓冲液是终浓度分别为10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)和1mmol/L EDTA(Ph8.0)的混合液。（4）10%SDS：称取10.0g SDS 慢慢转移到约含80ml水的烧杯中，用磁力搅拌器或加热至68度助溶，搅拌至完全溶解，用水定容至100ml 。（5）蛋白酶K：将200mg蛋白酶K加入到8.0ml无菌双蒸水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要漩涡混合，加水定容到10ml，不需灭菌分装成小分，储存于-20度。（6）5mol/L NaCl：在80ml蒸馏水中溶解29.22g NaCl，加水定容至100ml，分装后高压灭菌。（7）CTAB/NaCl溶液：称取4.1g NaCl溶解于80ml蒸馏水中，缓慢加入10g CTAB ，可加热至65度溶解，定容至100mL。（8）酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按1：1的比例混合用Tris饱和的酚与氯仿/异戊醇（24：1）。（9）其他试剂：异丙醇，70%乙醇等。3. 制备细菌基因组（1）菌体收集：将2mL培养至对数期的大肠杆菌DH5菌液5000rpm冷冻离心10min弃上清；（2）加190L TE悬浮沉淀，并加10L 10%SDS，1L 20mg/mL蛋白酶K，混匀，37保温1h；（3）加30L 5mol/L NaCl，混匀； （4）加30L CTAB/NaCl溶液，混匀，65保温20min； （5）加入300L酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提，5000rpm离心10min，将上清液移至干净离心管； （6）加入300L氯仿/异戊醇（24：1）抽提，取上清液移至干净管中； （7）加300L异丙醇，颠倒混合，室温下静止10min，沉淀DNA； （8）5000rpm离心10min，沉淀DNA，加入500L70%乙醇，5000rpm离心10min，弃乙醇，吸干；（9）溶解于20LTE，取3L 用于琼脂糖凝胶电泳验证，其余-20保存。六、实训注意事项1.称量时严防试剂混杂，一把牛角匙用于一种试剂（或称取一种试剂后，洗净、擦干，再称取另一种试剂。）瓶盖不要盖错，及时贴上标签。2. 酚腐蚀性很强，并可引起严重灼