多糖结构分析.doc

一：多糖中的单糖组分分析一般对多糖进行完全水解，水解条件：封管0.53M硫酸或16M盐酸，80100水解2.58h即可。或控制水解条件，进行逐步水解，如封管0.025M硫酸，100水解15min，30min，45min等，水解液用碳酸钡或氢氧化钡中和，滤液浓缩后可用纸层析、薄层层析、气相层析或高压液相层析等鉴定。二：相邻单糖基连接方式分析将甲基化多糖水解得到甲基化的单糖，而此单糖上甲基化之羟基所在的碳原子就是连接键所在。高碘酸氧化是定量反应，Smith降解是将高碘酸氧化产物进行还原，酸水解或部分水解，从高碘酸的消耗量和不同产物的生成，便可进行糖苷键位置的判断-产物中若有一分子比例的甲酸生成而消耗两分子比例的高碘酸根时，表明多糖的非还原末端或非末端部分有1-6苷键相连的单糖基存在；产物中若有赤藓醇生成，则提示有1-4结合苷键；若有甘油生成，有1-6、1-2结合的苷键或有还原性末端葡萄糖基等；若产物中能检出单糖，如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等，则有1-3苷键存在。结合C-NMR确定连接位置。三：端基碳苷键构型分析1：酶解实验：不被淀粉酶水解的多糖，无-苷键，与纤维素酶有作用者，存在-苷键。2；IR：-型差向异构体的C-H键在8448cm处有一个吸收峰；-型的C-H键在8917cm处有一个吸收峰。但是，海藻糖、阿洛糖和异阿洛糖的-型和-型同时存在的情况下，就不能以次来判断。3：H-NMR：端基碳的值大于5.00ppm者，糖苷键为-型，小于5.00ppm者，则为-型。4；C-NMR：-型连接的C化学位移在97-101ppm，-型的在103105ppm。对甘露聚糖不能用化学位移判断-型或-型。可用裂分常数决定，一般J-=170HZ，为-型，160HZ者为-型。四：不同苷键组成比例及直链或环状结构分析不同糖苷键糖基比例分析可通过测C-NMR光谱相对面积来完成。可通过连接苷键的C-1相对峰面积的测定确定苷键糖基的比例。-（1-4）在直链和环状结构中其C与C的化学位移值均有差异，与文献值对照便可判断是直链或是环状结构。在IR中：一般地，吡喃糖苷在1100-1010 cm间有三个强吸收峰，而呋喃苷在相应区域只有两个峰。 以上摘自盛家荣等多糖的提取、分离及结构分析广西师院学报（自然科学版）1999年12月第16卷第4期一：多糖的纯度检查：1：比旋度法：比旋度相同者为均一组分。2：超离心法：多糖在离心力场作用下形成单一区带，说明微粒具有相同沉降速度，表明其分子的密度、大小和形状相似。3：高压电泳法。4：凝胶过滤法：由于凝胶具有一定大小的孔径，不同形状和大小的多糖分子在凝胶层析柱中移动速度不同，其流出液经示差检测仪检测，如只有一个峰，则表明为均一组分。5：纸层析法：取多糖水溶液点样于新华中速或慢速滤纸上，在室温下展开，显色，进行纯度检测。6:冻融法:取多糖溶液经过反复冻融，应无沉淀析出。7:光谱扫描法:采用紫外光谱在180640nm波长间扫描，在260nm、280nm处应无核酸和蛋白质的特征吸收峰。二：多糖的定性检测1 理化性质 主要包括溶解性、硫酸-咔唑反应(阳性)、蒽酮-硫酸试剂反应(阳性)、苯酚-硫酸试剂反应(阳性)、斐林试剂反应(还原糖试验)、双缩脲试验(阴性)、碘-碘化钾反应(阴性)、茚三酮反应(阴性)、三氯化铁反应、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)络合反应、比旋光度、特性粘度、电导率及PH值等。2 红外光谱(IR)分析 红外光谱成是糖结构研究重要手段之一。主要用于不同糖的鉴别、糖苷键及糖构型的确定、糖键上主要取代基的识别等。常用的是将干燥的多糖用KBr压片法在4004000cm 区间扫描做红外光谱分析。3 核磁共振(NMR) 糖的核磁共振波谱主要是 H、C核磁共振波谱。多糖在HNMR谱图上，大多集中在40 55ppm范围内。而C NMR主要应用于多糖结构分析，如异头碳的构型问题、多糖残基中取代位置和分枝点的确定、多糖中各残基种类和比例的确定等。与用于糖类化合物结构研究的经典方法相比，高磁场NMR方法能产生较完全和详细的结构信息，并且可以在有或没有背景知识的情况下获得糖类化合物最完全的结构信息及其在溶液中或固态的行为，同时还可通过计算机把样品的H和C NMR谱数据与数据库信息进行比较来确定糖类化合物的结构。此外，2D-NMR、NOE及 N、P的NMR数据对糖链一级结构及其溶液构象的分析，也常被利用。糖类化合物的NMR谱参照标准通常是四甲基硅烷(TMS)，测定的溶剂多是中性或碱性重水(D2O)，但在非质子溶剂如氘代二甲亚砜、氘代吡啶中，可获得分辨率较好的谱图。三：多糖的定量检测1:直接测定多糖含量:多采用高效毛细管电泳法、高效液相色谱法和酶法等进行多糖含量的测定。2:利用组成多糖的单糖的性质进行测定 其中利用单糖缩合反应而建立的方法最多。（1）显色剂-酸法：多糖在酸作用下水解、脱水生成糖醛类化合物，与酚类、芳胺类等缩合成有色化合物。根据所用强酸和显色剂的不同，这类方法主要有9种：2蒽酮硫酸溶液、硫酸；二苯胺醋酸溶液、盐酸；间苯二酚乙醇溶液、盐酸；地衣酚乙醇溶液、盐酸；80苯酚水溶液、硫酸；2a-萘酚乙醇溶液、硫酸；色氨酸、硫酸；3水合L-半胱氨酸盐酸盐、硫酸；咔唑、硫酸。也有采用苯酚-硫酸法加酶联免疫测定仪快速测定多糖含量的。（2）滴定法：取多糖水解液，加入指标剂，滴定经标定过的溶液，根据样品水解液消耗体积，计算其含量。常用的滴定方法有斐林氏滴定法、间接碘量滴定法、氧化还原滴定法等。3 :DNS法(3，5二硝基水杨酸比色法) 利用与多糖水解产物还原糖共热后还原成棕红色氨基化合物，于540nm处有特征吸收。4 重量测定法 先用80 的乙醇提取以除去单糖、低聚糖、生物碱等干扰性成分，然后用水提取其中所含的多糖类成分。5 生化分析法 将多糖水解，再用自动生化分析仪测定多糖含量，具有灵敏快速、样品用量少、精密等优点。6 石墨炉原子吸收光谱法(GFAAS) 如采用阿利新蓝(Alcian Blue)与尿样中氨基多糖(GAG)在PH=58的醋酸钠溶液中，发生沉淀反应生成GAG铜复合物。离心，分离沉淀物，以石墨炉原子吸收光谱法测定沉淀物中铜含量，间接计算GAG含量 。四：多糖的结构分析1 糖的组成分析 多糖样品经水解进行单糖的组成分析。纸层析 将多糖溶于水后，点样于层析纸上，经展开显色后，与已知糖的斑点颜色及Rf值进行比较而定性鉴定，或将斑点洗脱下来，用常用的微量分析方法定量测定。薄层色谱法(TLC) 操作简单、快速、经济、可靠，且可同时鉴别多个样品，独具特色，与扫描技术，配合数码成像和数据处理，还可瞬间形成轮廓图谱，并给出各峰的积分值，加大了信息量，从而提高综合分析能力。分离糖的TLC有硅胶色谱、纤维素色谱、硅藻土色谱及氧化铝色谱。由于糖是多羟基化合物，极性强，容易吸附，多采用含有无机盐水溶液制备硅胶薄板，使硅胶薄层吸附能力降低，斑点集中，对分离有所改善。高效液相色谱法(HPLC) 具有分离效率高，分析速度快，灵敏度高，易于实现自动化等特点。中药样品中含有的成分绝大多数均可在高效液相色谱仪上进行分析检测，且它给出的是高分辨率的轮廓图谱，重现性好，操作相对容易，而且是封闭系统色谱，在线操作外界影响小，色谱稳定性好，在线检测设备可选性较大。因此HPLC在药品的质量控制(如主要成分的定性定量分析、杂质的限量检查和测定、稳定性考察等)、中药的成分研究等方面都是重要的分析手段。HPLC在多糖类药物中的应用主要在于多糖含量的测定、单糖组成分析及纯度检测。气相色谱法(GC) 具有高效、高选择性、高灵敏度、用量少、分析速度快等优点，是多糖结构分析中最重要的手段之一。它与质谱联用可以得出有关单糖残基类型、键的连接方法、糖的序列和糖环形式、聚合度等多种结构信息 。GC要求试样具有良好的挥发性和热稳定性，多糖本身不能在高温下直接挥发，因而需要将大分子多糖降解为结构单糖或寡糖，并且将其衍生成具有易挥发、对热稳定的衍生物。毛细管电泳法(CE) 快速、高效和高灵敏度、所需样品少等特点正被广泛应用。一般多糖经酸或酶水解后进行CE，与标准品对照后计算出各单糖的峰面积进而推算出其单糖组成及其比率。定性分析主要通过进行多糖的指纹图谱来确定糖组成结构的特征。定量分析目前只限于多糖中某特定功能团和组成多糖各单糖的定量分析。2 质谱在多糖结构解析上的应用 近年发展了各种软电离技术，如化学电离(I)、场致电离(FI)、场解析电离(FD)、化学解析或称直接化学电离(DCI)、快速原子轰击法(FAB)以及电喷雾电离质谱(ESIMS)和基质辅助的激光解析质谱(MALDIMS)，用飞行时间(TOF)检测器来检测。应用质谱技术如联动扫描、MSMS方法、不同衍生化处理、同位素标记方法、GCMS和LCMS以及各软电离技术的配合使用，质谱法在糖的序列分析和结构鉴定研究中正越来越起着重要作用。3 X一射线纤维衍射在多糖构型分析中应用 X-射线纤维衍射与计算机模拟技术相结合可以从原子水平对多糖分子结构进行分析。大多数多糖均不能形成单晶，不适用于常规X-射线单晶衍射。而X-射线衍射的另一方式纤维衍射则在这方面展示了越来越大的应用空间，再加上立体化学方面的信息包括键角、键长、构型角和计算机模拟，就可以准确地确定多糖的构型。尽管研究多糖的立体构型有多种方法如电子衍射、旋光测定、核磁共振等，但X-射线纤维衍射与计算机模拟技术相结合仍不失为当前确定多糖立体构型最为有力的工具。4 分子量测定1 渗透压法 利用膜渗透压计测定范围在在1万50万之间的多糖分子量。采用渗透压法测定分子量，要求样品内不含分子量小至能透过半透膜的物质。2 蒸气压法利用蒸气压渗透计测定范围在50010000之间的多糖分子量。3 端基法其基本原理是测定单位重量样品中所含可测端基之数，计算检样的分子量。常用的测定多糖还原端基的定量分析方法有3，5二硝基水杨酸比色法、碱性铜盐试剂反应滴定法、多糖转化为氰醇测定法等。4 光散射法采用光散射分子量测定仪进行分子量测定，其关键在于所要测定的溶剂和溶液的除尘，常用方法是超离心沉降或过滤处理法等。5 粘度法粘度法分子量测定先是测定样品特性粘度 ，然后通过换算方程，即经验式 =KM。计算分子量。本法所需设备简单，操作较易掌握，因此常用于多糖分子量测定。6 凝胶过滤法本法需用已知分子质量的葡聚糖标准品进行凝胶层析，洗脱，收集，用硫酸葸酮法检测多糖，分别求得相对应的洗脱体积Ve。再用蓝色葡聚糖(相对分子质量为2000000)上柱求得柱的外水体积V。，以VeV。为纵坐标，lgMr为横坐标，得到分子量测定标准曲线。取待测分子量的多糖样品与标准品层析相同的条件操作，求得相应的洗脱体积，求得Ve/V。值，查标准曲线可求得多糖的分子质量。7 高效液相色谱法 本法只将凝胶过滤法中的凝胶柱改为高效液相色谱柱，其余同凝胶过滤法。8 超过滤法 应用适宜的分子量截留值的超过滤膜，以各种已知分子量不同的多糖作标准进行超滤测百分滤过量，然后以百分滤过量对分子量作图得出标准曲线，在相同超过滤膜和相同测定条件下测定样品的百分滤过量，从标准曲线上即可求出近似的分子量。9 凝固点下降法 应用凝固点下降法可测定多糖的摩尔质量，且准确度优于蒸气压法。10基底辅助激光解吸电离质谱法 基质辅助激光解吸电离质谱作为一种新的“软电离”技术，由于其在分子量测定等方面快捷、直接、优质及良好的软电离型，近年来在生物化学领域得到广泛应用。 以上摘自陈京等多糖类药物的质量标准研究现状及其进展浙江中医学院学报2004年5月1D-HNMR 通常型糖苷的异头质子大于5.0，型一般小于5.0。另外偶合常熟3J1,2大于6，同时化学位移小于5.0者为型。若化学位移大于5.0，且3J1,2小于4则是型。 以上摘自吴伟等中药多糖分析方法的研究进展时珍国医国药2007/18/3在13CNMR中苷碳核C1的位置一般在85-105ppm（对TMS而言），C2C3C4C5在70-75ppm。如果上述这些碳核上有分支或键合则位移到75-85ppm。键合或非键合的C6在60-75ppm。可将70-75ppm范围称作是