USP-35-1113 微生物鉴定、鉴别及菌株分型指导原则翻译稿.pdf

1113 微生物鉴定 鉴别及菌株分型指导原则 微生物鉴定 鉴别及菌株分型指导原则 前言前言 药品原辅料 生产用水 生产环境 中间体以及终端产品等微生物检测时 需要对其特 性进行确定 需采用适当的鉴定及菌株分型 见章节末端表格 常规微生物特性确定包括 菌落形态 细胞形态 杆菌 球菌 细胞排列方式 产胞结构 革兰氏染色或者其他染色 方法 和特征生化反应 氧化酶 过氧化氢酶 凝固酶反应 在非无菌药品生产过程和一 些无菌制剂的生产环境中 微生物鉴定到这个水平足以达到风险评估的目的 有时 需要更精确的方法鉴定微生物到属或种水平 另外 有些适宜的方法可以进行株 水平鉴定 这有助于调查和确定微生物菌株的来源 当某种微生物高频次出现或者超出产品 使用限量时 鉴定该菌种是必须的 另外 微生物鉴定有助于无菌过程控制 当无菌试验出 现阳性反应时 需要评估可能的污染来源 如培养基倾注等环节 微生物鉴定体系基于不同的分析方法 有时 鉴定结果受方法和数据库的限制 微生物 鉴定是通过与既定的标准或参考菌株 如模式菌株 比较 根据匹配特性 基因型和 或表 型 确定其种属 如果某种微生物在数据库中不存在 则得不到鉴定结论 制造商应根据应 用需要不断扩充其数据库 研究者应当考虑哪种鉴定系统数据库符合其需求 根据需要鉴定 的水平 属 种 株 研究者有时需要选择合适的方法进行常规微生物鉴定试验 关于微生物鉴定试验 见 USP 62 章节 无菌产品的微生物检验 该章提到通过微生 物在选择培养基或者特征培养基上的形态特征鉴定微生物 同样 USP 71 章 无菌检验 提到 已经分离并鉴定的菌株 因为试验材料或者技术方法的原因不能再生长 判定试验无 效 USP 1116 章 洁净室和其他受控环境的微生物评价 推荐分离微生物鉴定要达到一定 比率以支持环境监测项目的需要 菌株的分离与纯化菌株的分离与纯化 菌种鉴定第一步是分离得到单个纯培养菌落 一般采用平板划线法 通过四分之一区划 线的方法 在适宜的固体培养基上划线 得到单个菌落 同时得到足够的菌体量进行表型描 述 操作人员应熟悉微生物表型描述 如细胞大小 形态 芽孢形成 细胞组成 抗原性 生化反应 药物敏感性 微生物表型受菌株分离源 培养基 生长条件的影响 见表 1 表表 1 表型特征用于微生物分类学表型特征用于微生物分类学 分类分类 特征特性特征特性 菌落 菌落形态 菌落颜色 形状和大小 色素产生 形态 菌体形态 菌体大小 菌体形状 鞭毛类型 储存物质 革兰氏染色 芽孢染色 产孢情况 生理特性 耐氧性 pH 范围 最适温度和范围 抗盐性 生化特性 碳源利用 碳水化合物氧化和发酵 酶反应 抑制 胆盐耐受 抗生素敏感性 染料耐受 血清 凝集反应 免疫荧光抗体反应 化学分类 脂肪酸谱 微生物毒素 全细胞组成 生态学 菌株来源 微生物的表型受培养条件的影响 对应的 微生物的基因型不受培养条件的影响 获得 纯培养单菌落 菌株的基因型分析就不会受到分离用培养基以及菌体活力的影响 表 2 微生 物基因型判定指标 表表 2 基因特征用于微生物分类学基因特征用于微生物分类学 分类分类 特征特性特征特性 基因型 DNA 碱基含量 G C 含量 限制性片段多态性 DNA 探针 系统发育学 DNA DNA 杂交 16S 和 23S rRNA 序列分析 细菌分类根据伯杰氏细菌手册系统细菌学 伯杰氏细菌手册 1 描述 经比较分析后获得 鉴定结果 未知微生物的 DNA 与已知微生物的 DNA 进行比较 可确定两者相关性 基因 型鉴定 表 2 是通过 DNA 杂交 限制性片段多态性 和 或 DNA 探针分析实现 例如 DNA DNA 杂交同源性超过 70 表明微生物为同种 系统发育分析 表 2 通过比较细菌 16s rRNA 部分序列 霉菌和真菌 23s rRNA 部分序列实现 聚合酶链反应 PCR 用于扩增这些基 因 通过电泳和双脱氧链终止法进行测序 序列的比较可使用合法经验证的专业数据库或公 共数据库 注意 公共数据库可能未被验证 初筛和特征特性描述初筛和特征特性描述 来自药品原辅料 生产用水 生产环境 中间体以及终端产品的微生物 通过常规的培 养基分离培养时 可能会产生选择性压力 微生物通过调节代谢水平以适应周围条件 如从 贫瘠的环境转移到适宜的培养基和培养条件时 可能会产生选择性压力 这种变化可通过小 心操作解决 从基础选择培养基单菌落快速划线转移至固体培养基 得到用于鉴定的具有代 表性的单菌落 第一步是通过革兰氏染色确定菌落的细胞形态和部分生化反应 这是表型鉴 定的关键步骤 如果得到错误的细胞特征信息 则后续选择错误的鉴定试剂盒 导致最终结 果的错误 一些初筛试验如下所述 革兰氏染色革兰氏染色 革兰氏染色包括四步 结晶紫 基础染色 碘液 助染 酒精或酒精丙酮 脱色 品红 复染 在最佳的染色条件下 革兰氏阴性细菌保留结晶紫呈紫色 革兰氏阴性菌结 晶紫被脱色 只含有品红呈红色 有些菌革兰氏染色可变 易犯的错误有 过度加热固着可 能使革兰氏阳性菌变为革兰氏阴性菌 老龄培养物可能导致革兰氏染色不确定 脱色剂使用 过多会出现假阴性 使用太少有可能出现假阳性 将细菌固着在载玻片上时 使用甲醇固着 比加热更有优势 在某些情况下酒精固定会得到更一致的革兰氏染色结果 以上任何一种方 法 允许革兰氏染色结果有时错误 因此需要镜检进一步观察细胞形态 芽孢染色芽孢染色 使用孔雀绿染液进行芽孢染色 设置阳性对照并允许芽孢染色有时错误 生化反应筛选生化反应筛选 关键生化反应测试包括 1 通过氧化酶反应在非发酵菌 氧化酶阳性 和肠道菌 氧 化酶阴性 中分离出革兰氏阴性的棒状杆菌 2 通过过氧化氢酶反应区分葡萄球菌 过氧化 氢酶阳性 和链球菌 过氧化氢酶阴性 3 通过凝固酶反应区分凝固酶阴性菌 假定非致 病性 和凝固酶阳性葡萄球菌 致病菌 对于许多类型的生产环境生物负载调研 这几个关键生化反应可提供足够的信息以进行 下一步评估 但是 当需要更深入的评估以分析环境负载属性或来源时 微生物需要鉴定到 种 属或株水平 种水平或株水平的微生物鉴定对于评估微生物污染风险和来源至关重要 通过表型进行微生物鉴定通过表型进行微生物鉴定 表型方法是通过基因表达产物区分不同的微生物 通常这需要相当数量的单菌落纯培养 物 微生物活化 繁殖和鉴定受到培养条件的限制 事实上许多环境中的微生物目前还不能 通过常规培养条件分离 此外 由原代微生物传代的分离的得到的新鲜子代培养物 其表型 性质可能不会充分表达 但是 很多鉴定系统都是基于碳源利用 生理生化反应而设计的 如基于气相色谱分析的脂肪酸鉴定分析系统 基于飞行时间质谱 MALDI TOF 的全细胞组 分分析系统 因此这些系统要求在标准的培养条件下培养以得到一致的分析结果 微生物表 型鉴定方法成功地应用于食品 水 临床和药品微生物检验实验室 2 根据表型鉴定得到 的信息 微生物学家能够采取相应措施减少产品风险 也能够了解环境微生物群落的变化 在许多质量控制中 单独进行表型鉴定是有效的 帮助科学家获得信息并推荐合适的纠正措 施 通过基因型鉴定微生物通过基因型鉴定微生物 基因型微生物鉴定方法理论上是更可靠 因为大多数微生物的核酸序列是高度保守的 常用的测定方法有 DNA DNA 杂交 PCR 16s 和 23s rRNA 测序 多位点序列分型 MLST 焦磷酸测序 DNA 探针 核糖分析 ribotyping 对于微生物学家 这些方法在技术上具有挑 战性 同时需要昂贵的分析设备和耗材 通常 这些分析是由与企业合作的实验室 政府实 验室 大学 科研院所 大企业自有的实验室来完成 因此 基因型鉴定在产品放行等关键 紧急情况下受到限制 进一步说 株水平鉴定时 分析人员必须确认方法是适宜的 16 s rRNA 序列前 500 个碱基对于种水平的鉴定很有用 但是对于相近种区分度不够 对应的 限制性核酸内切酶消化的 Southern 杂交可以有效区分同种不同株 如果出现两个 相同的条带 这说明这种限制性核酸内切酶在这两个微生物 DNA 条带中具有相同的切割位 点 确认这两种微生物是相同的 需要两个或更多的限制性核酸内切酶消化 并产生相同的 酶切条带 与微生物鉴定相比 核酸鉴定可以用来筛选特殊的微生物 这种方法的步骤是采集样品 提取核酸 放大目标物 杂交和检验 死细胞要进行 DNA 扩增 可以先反转录得到 rRNA rRNA 转录得到 DNA 采用 PCR 对 DNA 进行扩增 其中的问题包括检测的微生物变异 检出限 基质影响 阳性截止验证 仪器和系统残留物 诊断的准确性和重现性 微生物鉴定方法的验证微生物鉴定方法的验证 微生物鉴定的验证包括血清学试验 化学试剂 参考菌株和仪器 微生物鉴定系统的验 证包括 1 现有鉴定系统与常规鉴定系统平行试验 测试的分离菌株数达到 50 株 在 鉴定中的任何差异都需使用参考方法进行仲裁 2 50 株菌中应包含 12 15 种已知的具有 代表性的不同菌株 3 确认 20 50 株菌种鉴定结果 应包括 15 20 个不同的种 并与参考 实验室菌株样品鉴定结果一致 3 每次鉴定实验都需要有合适的质控菌株 质控菌株由供 应商或法规标准推荐 同时包括质控菌株的方法验证 使用鉴定系统时 需考虑菌种是否包含在鉴定系统数据库中 通常 如果该菌种包含在 鉴定数据库中 90 概率可以得到匹配的鉴定结果 相近的微生物菌种通过鉴定系统鉴定具 有挑战性 例如非发酵细菌 棒杆菌 凝固酶阴性葡萄球菌 通常鉴定结果匹配度较低 微生物鉴定系统结果错误影响程度由高到低依次为 1 属鉴别错误 2 种鉴别错误 3 没有结论 错误鉴定结果导致错误的纠正措施及产品处置 由于鉴定系统数据库中不包含该种微生物 或者这种微生物的数据系统参数缺乏包容性 或者这种微生物在系统设置的标准培养条件下不生长 或者这种微生物分类地位未被正确描 述 都可能引起这种微生物在鉴定系统中无法鉴定或得不到正确结果 这类的微生物菌种可 送至微生物鉴定系统供应商处进一步研究 后续添加到鉴定数据库中 或者使用替代方法 如基因型鉴定 确认后可加入内部数据库 微生物菌种的错误鉴定有时很难判断 任何微生 物的鉴定都要考虑与形态 生理生化特征 分离源等信息的符合性 对于大多数非致病菌 如葡萄球菌 棒杆菌 和其他小的多形性革兰氏阳性杆菌 微球菌属 通常只需要鉴定到 属水平 最重要的验证试验是准确性和重现性 这些验证方法可以如下定义 准确性 正确结果的数量 结果总数量 100 重现性 正确的结果一致的数量 结果总数量 100 对于准确性和重现性 需要建立适宜的判别标准 并具有可操作性 其他验证方法包括灵敏性 特异性 阴性和阳性预测值等 通过一个例子可以很好地说 明 临床微生物实验室用性传播细菌奈瑟氏球菌 Neisseria gonorrhaeae 比较 DNA 杂交探 针的分离频率 3 临床标本分离频率的历史数据是 10 该实验室使用了 100 个分离样本 结果见表 3 表表 3 DNA 探针和培养方法阴性和阳性结果的分布比较探针和培养方法阴性和阳性结果的分布比较 培养结果培养结果 DNA 探针结果探针结果 阳性 阴性 阳性 9 2 阴性 1 88 灵敏性 9 9 1 100 90 特异性 88 88 2 100 97 7 阳性预测值 9 9 2 100 81 8 阴性预测值 88 88 1 100 98 9 需要注意的是实验中阳性预测值 PPV 不是固定的 其取决于临床微生物样本的普遍程 度 疾病 么 P 包容 排他 阳性 阴性 分析 Kap 系系统统 的第 架 物被 Bras 不同 相似 PPV 直接和 病的比例更高 PPV 就是 10 这些函数的 表表 4 两两 培养方法培养方法 阳性 阴性 合计 ISO 5725 ISO 5725 2 性和再现性的 容性 a 他性 d 性预测值 性预测值 析准确性 ppa 指数 2 统统发育学分发育学分析析 伯杰氏系 第八版和第九 基于核糖体 系统进化树 被分类修订并 siliensis 通 同的种 4 但 基因型和表 似表型的菌株 和疾病的流行 高 PPV 就会 00 NPV 为 的数学推导见 两两行两列联表行两列联表采采 PC 阳 a 阳 c 假 a 5 1 1994 准确度 1994 准确度 的基本方法 a b 10 c d 10 a a c d b d a d a 2 adbc a 析析 系统鉴定手册 九版也有很大 体小亚基 16S 树或树形图显 并重新命名 通常 微生物 但有时也有例 表型有时不能 株具有不同的 行程度成比例 会变大 阴 为 0 见表 4 采采用培养方法用培养方法和和 CR 方法方法 性 性 假阳性 c 度 真实性和 真实性和精密 00 00 100 100 a b c d a c c 册 第二版和 大的不同 伯 S RNA 片段的 显示微生物间 例如 黑曲 物序列相似性 例外 能统一 例如 的基因型 有时 例 在这个例 阴性预测值 和和替代替代 PCR 方方 阴性 b 假阴性 d 阴性 b d 精密 的测量 密 的测量方法 100 d a b 第一版有很大 伯杰氏系统鉴 的分析 而不 的亲缘关系 霉 A Niger 性 97 可能 相同或相似 时 表型差异 例子中 如果 NPV 会变小 方方法 法 ISO 5725 性 量方法和结果 第 法和结果 第 2 部 b d 大的不同 与 鉴定手册 的 不是表型结构 该技术的应 r ATCC 16 能为不同的属 似基因型的菌 异显著的菌株 果测试的这一 小 如果全组 5 1 和和 5725 2 合计 a b c d 第 1 部分 总 部分 标准测量 与 伯杰氏细 的组织结构根 构 应用一些使得 6404 重命名 属 序列相似 菌株 具有不 株属于相同的 一组人中感染 组人都感染了 2 2004 总则和定义 量方法的重复 细菌学鉴定手 根据系统发育 得众所周知的 为巴西曲霉 似性 99 可 不同的表型特 的种或属 多 这种 那 手册 学框 微生 A 可能为 特征 相分 类的定义 5 为 采用多相的方法 如微生物生理生化特征 表型和基因型数据 微生物来 源等 共同进行微生物鉴定 尽量避免依靠单独的基因型数据 而不考虑微生物生理生化特 征 历史试验数据 分离源等信息 术语词汇表术语词汇表 微生物分类微生物分类 根据微生物的相似程度和亲缘关系进行分类 微生物鉴定微生物鉴定 广泛的分类 例如 细菌 酵母或霉菌 狭义的分类 例如 属和 或种 或 分离自哪个实验室 微生物生理生化特征微生物生理生化特征 通过菌落生长情况 细胞形态 染色 关键诊断数据等描述实验室分 离菌株 通常以调查为目的而不是鉴定 例如 非致病性葡萄球菌 Mol GC 染色体 DNA 中鸟嘌呤 胞嘧啶的碱基百分含量 注 GC AT 100 系统发育种系统发育种 基因组 DNA 同源性大于 70 Tm 值 5 杂交退火温度 包含模式菌 株的许多株的集合为一个系统发育种 多相分类多相分类 通过分子生物学 生理学 形态学 血清学 生态分布等集合信息进行微生物菌 种的分类 相关性相关性 两种或多种微生物在系统发育树上相似度及聚类关系 rRNA 序列序列 DNA 序列编码 rRNA 用于蛋白合成 在同一种中具有高度保守的特性 在分 类和鉴定中 是确定微生物菌种间系统发育距离的有用标尺 菌株菌株 分离来源清晰 特征特性描述完整的纯培养物 模式菌株是种的代表菌株 参考信息 明确 如分离历史 特征特性 保藏情况等 菌株分型菌株分型 菌株分型是临床和公众健康流行病学微生物调查的组成部分 鉴定方法包括脉冲 场凝胶电泳 PFGE 核型分析 riboprinting 随机引物聚合酶链反应 全基因组限制 性酶切图谱等 以确定菌株是否来自于同一来源 参考文献 1 Bergey s Manual of