凝胶电泳技术.ppt

凝胶电泳技术 电泳 electroghoresis 带电物质在电场中向相反电极移动的现象 电泳技术就是利用在电场的作用下 由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小 形状等性质的差异 使带电分子产生不同的迁移速度 从而对样品进行分离 鉴定或提纯的技术 自由界面电泳没有固定支持介质 所以扩散和对流都比较强 影响分离效果 于是出现了固定支持介质的电泳 样品在固定的介质中进行电泳过程 减少了扩散和对流等干扰作用 凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展 使电泳技术成为分析蛋白质 核酸等生物大分子的重要手段之一 最初使用的凝胶是淀粉凝胶 但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶 电泳的基本原理 在电场中 推动带电质点运动的力 F 等于质点所带净电荷量 Q 与电场强度 E 的乘积 F QE质点的前移同样要受到阻力 F 的影响 对于一个球形质点 服从Stoke定律 即 F 6 r 式中r为质点半径 为介质粘度 为质点移动速度 当质点在电场中作稳定运动时 F F 即QE 6 r 球形质点的迁移率 首先取决于自身状态 即与所带电量成正比 与其半径及介质粘度成反比 除了自身状态的因素外 电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率 电泳迁移率 m 是指在单位电场强度 1V cm 时带电分子的迁移速度迁移率与带电分子所带净电荷成正比 与分子的大小和缓冲液的粘度成反比 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷 在外加电场作用下向正极泳动 DNA分子在凝胶中泳动时 有电荷效应与分子筛效应 不同DNA的分子量大小及构型不同 电泳时的泳动率就不同 从而分出不同的区带 为了获得好的电泳结果 应尽量减少电荷效应 增加分子筛效应 常用的凝胶电泳有两类 琼脂糖凝胶电泳 分辨率稍低 适于较大分子 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分辨率高 适于较小分子 一 影响凝胶电泳迁移率的因素 一 样品的物理性质1 分子大小线状双链DNA分子长度 碱基对数目bp 的对数 log10 与迁移距离成反比 以此来测定DNA片段 线性双链 的分子量准确且方便 EB嵌合使迁移率下降15 当DNA分子大小超过20kb时 普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开 此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小 因此 就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时 分子大小不宜超过此值 2 分子的空间构型 即使分子量相同 构型不同 其迁移率也不同 DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大 比如质粒分子 泳动率的大小顺序为 共价闭合环状DNA covalentlyclosecircularDNA cccDNA 超螺旋构型 lDNA linearform 线型 质粒的两条链均断裂 线性分子 ocDNA 开环DNA opencircularDNA ocDNA 它的双链中的一条保持完整的环状结构 另一条单链上有一到几个切口 但是由于琼脂糖浓度 电场强度 离子强度和溴化乙锭等的影响 会出现相反的情况 3 带电量 核酸分子是两性解离分子 pH3 5是碱基上的氨基解离 而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离 所以分子带正电 在电场中向负极泳动 而pH8 0 8 3时 碱基几乎不解离 而磷酸基团解离 所以核酸分子带负电 在电场中向正极泳动 不同的核酸分子的电荷密度大致相同 因此对泳动速度影响不大 4 碱基组成 对迁移率影响不明显 单链DNA形成发头结构 影响迁移率 单链 1kb 小于双链DNA 1kb 二 支持物介质 种类和浓度 核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质 琼脂糖是一种聚合链线性分子 含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同 适于分离不同浓度范围的核酸分子 聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺 Acr 在N N N 四甲基乙四胺 TEMED 和过硫酸铵 AP 的催化下聚合形成长链 并通过交联剂N N 亚甲双丙烯酰胺 Bis 交叉连接而成 其网孔的大小由Acr与Bis的相对比例决定 凝胶浓度浓度越小 孔径越大 浓度越大 孔径越小 不同浓度琼脂糖凝胶的有效分离范围 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围 三 电场强度电场强度是指单位长度 cm 的电位降 也称电势梯度 1 5V cm 低压 低压时 线性DNA迁移率与电压成正比 而对于大片段电泳 甚至用0 5 1 0V cm电泳过夜 电场强度愈大 带点颗粒的泳动越快 但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小 高电压影响凝胶的分离范围 使分辨率下降 因为随电压上升 不同长度DNA泳动的增加程度不同 凝胶有效分离范围随电压上升而下降 高压电泳 20 600V cm 电场强度 1000 2000V 电压 必须用PAG作介质 四 电泳缓冲液 种类 pH 离子强度 1 pH值 决定带电颗粒的解离程度 缓冲液pH常偏碱性或中性 此时核酸分子带负电 向正极移动 2 离子强度 离子强度小 溶液的导电性小 带电颗粒泳动慢 离子强度大 溶液的导电性高 带电颗粒泳动快 过高 产生大量热 胶熔化 或使DNA变性 3 种类 TAE Tris 醋酸 EDTA 缓冲能力差 电流大易发热 长时间使用阴极为碱性 阳极为酸性 需要循环使两极的pH一致 但价格便宜 TBE Tris 硼酸 EDTA 缓冲能力强 首选TBE TPE Tris磷酸 EDTA 缓冲能力强 但回收DNA易与DNA一起沉淀 影响酶反应 TNE Tris醋酸钠 EDTA 电流大 适合于长时间低压电泳 分辨率高 在缓冲液中加入EDTA 可以鳌合二价离子 抑制DNase 保护DNA TBE一般配10 或5 的贮存液 都以1 TBE作为使用液进行琼脂糖凝胶电泳 但0 5 的使用液已具备足够的缓冲容量 进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小 故通过缓冲液的电流量通常较大 需要使用1 TBE以提供足够的缓冲容量 TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物 为避免这一问题 可在室温下用玻璃瓶保存5 溶液或高压灭菌 DNA电泳带糊的原因 DNA降解 应避免核酸酶污染 电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液多次使用后 离子强度降低 pH值上升 缓冲能力减弱 从而影响电泳效果 建议经常更换电泳缓冲液 所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V cm 温度 30 巨大DNA链电泳 温度应 15 核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力 4 DNA上样量过多减少凝胶中DNA上样量 5 DNA样含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐 6 有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白 7 DNA变性电泳前勿加热 用20mMNaCl缓冲液稀释DNA 二 核酸电泳的指示剂与染色剂核酸电泳常用的指示剂有两种 溴酚蓝 bromophenolblue Bb 呈蓝紫色 二甲苯晴 xylenecyanol Xc 呈蓝色 它携带的电荷量比溴酚蓝少 在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢 在0 6 1 1 4 和2 琼脂糖凝胶电泳中 溴酚兰的迁移率分别与1Kb 0 6Kb 0 2Kb和0 15Kb的双链线性DNA片段大致相同 在1 和1 4 琼脂糖中电泳时 二甲苯青的迁移速率分别与2Kb和1 6Kb的双链线性DNA大致相似 指示剂一般与蔗糖 甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液 loadingbuffer 载样缓冲液的作用 增加样品密度 使其比重增加 以确保DNA均匀沉入加样孔内 在电泳中形成肉眼可见的指示带 可预测核酸电泳的速度和位置 使样品呈色 使加样操作更方便 配方 将0 25 溴酚蓝 0 25 二甲苯青FF或分别 或同时加入或30 甘油水溶液 或40 W V 蔗糖水溶液 或15 聚蔗糖 Ficoll400 中 二 染色剂核酸电泳后 需经染色后才能显现出带型 最常用的是溴化乙锭染色法 其次是银染色 目前还有其他不仅安全的染色剂 溴化乙锭 ethidiumbromide EB 最常用260nm 300nm 360nm 发出590nm橙红色 溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团 它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性 在高离子强度的饱和溶液中 大约每2 5个碱基插入一个溴化乙锭分子 当染料分子插入后 其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用 这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近 导致与DNA结合的染料呈现荧光 其荧光产率比游离溶液中染料有所增加 DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料 而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射 这两种情况下 被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来 由于溴化乙锭 DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20 30倍 所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭 0 5ug ml 时 可以检测到少至10ng的NDA条带 溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸 DNA或RNA 但是染料对单链核酸的亲和力相对较小 所以其荧光产率也相对较低 事实上 大多数对单链DNA或RNA染色的荧光时通过染料结合到分子内形成较短的链内螺旋产生的 最低检出量100ng 染色完毕后 通常不需要脱色 但是在检测小量DNA 小于10ng 片段时 通常要将染色后的凝胶进行脱色 EB存在的情况下 线状DNA的电泳迁移率约降低15 因此 当需要知道DNA片段的准确大小 如DNA限制酶酶切图谱的鉴定 凝胶应该在无EB情况下电泳 电泳结束后用EB染色 EB在凝胶或染色液中的浓度为0 5g ml或0 1g ml 注意 EB见光易分解 应存棕色试剂瓶中于4 下保存 溴化乙锭可以嵌入碱基分子中 导致错配 溴化乙锭是强诱变剂 具有高致癌性 核酸吸收260nm紫外线 导致DNA的断裂 因此回收DNA应在长波紫外线下观察较好 以减少对DNA的损伤 荧光易淬灭 注意观察的时期 不要反复在紫外下照射 由于溴化乙锭具有一定的毒性 实验结束后 应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置 以避免污染环境和危害人体健康 1 对于EB含量大于0 5mg ml的溶液 可如下处理 将EB溶液用水稀释至浓度低于0 5mg ml 加入一倍体积的0 5mol LKMnO4 混匀 再加入等量的25mol LHCl 混匀 置室温数小时 加入一倍体积的2 5mol LNaOH 混匀并废弃 2 EB含量小于0 5mg ml的溶液可如下处理 按1mg ml的量加入活性炭 不时轻摇混匀 室温放置1小时 用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃 银染 银染色液中的银离子 Ag 可与核酸形成稳定的复合物 然后用还原剂如甲醛使Ag还原成银颗粒 可把核酸电泳带染色黑褐色 主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色 也用于琼脂糖凝胶染色 其灵敏度比EB高200倍 但银染色后 DNA不宜回收 EB的替代物 GoldViewDNA染料是一种可代替溴化乙锭 EB 的新型DNA染料 使用方法与之完全相同 采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA时 GoldView与核酸结合后能产生很强的荧光信号 其灵敏度与EB相当 在某些波段甚至超过EB 在100ml琼脂糖胶溶液中加入5 lGoldView即可 亦可在电泳缓冲液中以同样比例稀释后直接使用 在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光 而单链多聚核酸链呈红色荧光 因此 GoldView不仅能染双链DNA 也可用于染RNA和单链DNA GoldViewDNA染料在不同的波长下灵敏度有一定影响 建议使用312nm波长 弱点是它的荧光基团在紫外灯下非常容易淬灭 一般5 10min条带就会消失 GeneFinder具有安全 灵敏等突出优点 可以代替溴化乙锭 EB 作为各种核酸电泳的染色剂 与强致癌性的EB不同 GeneFinder 属于花青类染料 毒性很低 使用安全 可有效保护实验操作者和环境 GeneFinder 与dsDNA结合荧光信号可增强800 1000倍 其检测核酸的灵敏度比EB染色法平均高10倍左右 与美国MolecularProbe公司的SYBRGreenI染料的灵敏度相当 GeneFinder 染料最大吸收峰为470nm 与该染料结合的核酸呈现绿色荧光 GelRedTM是美国Biotium公最新研制的一种出色的红色荧光核酸染色剂 适用电泳前凝胶染色和电泳后凝胶染色 与其它核酸染色剂不同 它具备高灵敏度 高稳定性 低毒性和多功能等特性 这种染色剂不仅有出色的灵敏度 而且表现出高稳定性和广泛的适应性 可用于电泳前染色和电泳后染色 使用紫外透视器在300nm附近可得到最佳激发效果 在595nm附近显示红色发射光谱 因此 这种染色剂可使用普遍使用的300nm紫外透视器得到最佳的激发光谱 与EB预制凝胶不同的是 GelRedTM预制凝胶实质上并没有本底荧光 并且对低分子量的DNA片段也具有极高的灵敏度 和EB一样 使用GelRedTM制作的预制胶可以长时间贮存确不会降低性能 而SYBRGreen1和SYBRGold染色剂却不具备这种特性 当GelRedTM用于后制凝胶染色剂时 可以在30分钟内完全着色 而且因为没有本底色而免去再进行一次脱色或冲洗的过程 另外 由于GelRedTM的酸碱水解稳定性好 其染色剂可以批量制备以便日后使用 GelRedTM的另一个重要特性是它比EB更安全 但是价格昂贵 三凝胶电泳的种类 一 琼脂糖凝胶 agarosegel 琼脂糖是从琼脂 agar 中分离得到 由1 3连接的吡喃型b D 半乳糖和1 4连接的3 6脱水吡喃型阿a L 半乳糖组成 形成相对分子量为104 105的长链 琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布 当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接 形成孔径结构 而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径 表2 1给出了不同浓度凝胶对DNA片段的线性分离范围 由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用 因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化 象NaClO4能用于凝胶的裂解 一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理 随着实验技术的发展 也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶 1 低熔点琼脂糖凝胶 用于DNA片段的回收 且由于该种凝胶中无抑制酶 可在胶中进行酶切 连接等 2 高熔点凝胶 可分离小于1kb的DNA片段 专用于PCR产物的分析 3 快速凝胶 电泳速度比普通凝胶中快一倍 可节省实验时间 4 适用于DNA大片段的分离 5 其它类型 各生产商还开发很多类型的凝胶 可根据实验要求选择不同类型的 选择原则是考虑合适的机械强度和熔点 二 聚丙烯胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamidegelelectrophoresis PAGE 宜分离鉴定低分子量蛋白质 小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析 其装载的样品量大 回收DNA纯度高 长度仅相差0 2 即500bp中的1bp 的核苷酸分子即能分离 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体 在催化剂TEMED N N N N 一四甲基乙二胺 和过硫酸铵的作用下 丙烯酰胺聚合形成长链 聚丙烯酰胺链在交联剂 N N 一亚甲双丙烯酰胺参与下 聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶 丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定 1 非变性聚丙烯酰胺凝胶 在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时 DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外 更主要的是取决于DNA单链所形成的构象 在非变性条件下 DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象 这种构象由DNA单链碱基决定 其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用 主要为氢键 来维持 相同长度的DNA单链其顺序不同 甚至单个碱基不同 所形成的构象不同 电泳迁移率也不同 同等大小的DNA间的迁移率 由于空间结构影响可相差10 不能用未变性的聚丙烯胺凝胶电泳判断DNA的大小 2 变性聚丙烯胺凝胶电泳DNA变性 加热 极端pH 有机溶剂 尿素或甲酰胺导致DNA解链 电泳凝胶中进入变性剂 5M的尿素 使DNA为单链线性 变性DNA的移动速度与其碱基组成和序列几乎完全无关 可用于DNA序列分析等 聚丙烯胺凝胶电泳优点 1 分辨率高 2 载样量大 1cm 1mm的加