反相色谱法中缓冲盐的选择-现代液相色谱技术导论读书笔记(二).doc

反相色谱法中缓冲盐的选择-现代液相色谱技术导论读书笔记（二）反相色谱法在色谱中是最广泛的应用，分离中性样品和离子样品的首选。中性样品：样品不带正电荷或者负电荷的分钟哦，通常是由于样品酸或碱被离子化的结果。虽然一个中性分子意味着该样品没有酸性或碱性分子，然而实际情况并非如此。依赖于流动相的pH，样品中酸或碱可能在很大程度上（比如90%以上）体现出中性的（非离子化）形式，在这种情况下，色谱图和非离子化的化合物非常类似。离子化样品：酸、碱、酸碱混合物（含或不含中性化合物）。色谱柱常使用C18或C8，流动相常使用水和有机相的混合溶液。常用的有机溶剂为CAN（首选），甲醇，异丙醇，四氢呋喃等。水相通常是缓冲盐。一：流动相pH的确定在RPC中，色谱柱是非极性的，流动相是极性的。极性很强的分子和极性的流动相之间作用更强烈，在色谱柱行保留较弱，首先离开色谱柱。同样的，极性较弱的分子与非极性的色谱柱左右，后离开色谱柱。因此大小接近的类似分子在RPC的洗脱大致随着他们的极性减低而减慢。RPC的保留很大程度上是溶质分子和流动相或者色谱柱相互作用的结果。增加B%（有机相），会使流动相极性减小，增加溶质和溶剂的相互作用，溶质分子的保留都减少。提高温度同样减少溶质的保留。色谱柱疏水性增加同样会减少溶质分子的保留，如同一样品在氰基柱上比C18柱较快出峰（氰基柱的极性比c18强）。较高的极性会缩短样品在RPC上的保留时间。离子化会显著提高酸或碱的极性，从而导致该物质在RPC中的保留因子K下降。非电性分子 离子化分子酸：HA A-+ H+碱：B+H+ BH+ 疏水性 亲水性当pH增加时，酸失去质子而离子化，使在RPC中保留降低，当pH降低时，碱获得质子而离子化，使在RPC中保留降低。离子化的酸和碱俊宇他们的酸度系数Ka相关。当pH等于pka时，分子和离子化各占50%。下图一表示pH影响RPC保留行为的例子。碱性化合物pka=5，从上图可以看出，在和阶段（在pka1.5之外），保留时间随着pH变化不大，在阶段（pka1），保留时间随着pH变化呈线性关系。黑点对应的是pka与PH值相近。从上图我们可以看出调节流动相pH可以优化色谱的选择性和分离度。当流动相的pH等于化合物的pKa时，可以最大效应的调节分离度。但是同样在上图中，在阶段（pka1）阶段，由于保留时间随着pH变化呈线性关系，每当改变0.1个单位的pH可以使保留时间发生10%的变化，而在实际实验过程中流行相的pH会有微小的变化，如此会使分离的重现性较差，方法的耐受性较差。因此避免pH对保留行为的影响，所选流动相pH必须与样品的所有成分的pKa均不相等，且只有要求有1.5个pH单位的差异（和阶段）。由于大部分化合物的pKa大于4，所以在开始建立方法时可以采用pH较低的流动相（2pH3），可以降低pH微小变化的影响。下图表示5个化合物随着pH变化保留行为的影响。从上图我们可以看出：调节pH可以该此混合物中酸、碱和中性分子的保留时间，从而提高分离效果。随着pH升高保留时间显著增加的是碱性物质（化合物4和5,5更加明显为强碱），随着随着pH升高保留时间缩短的是酸性物质（化合物1和2），随着随着pH升高保留时间变化不大的是中性物质或者在该范围内完全离子化的物质。对于同时带有酸性和碱性基团的两性化合物，在RPC中的保留时间和流动相pH之间的关系会更复杂。二：缓冲液的选择：分离酸和碱，缓冲溶液对维持流动相恒定的pH和提高保留时间的重现性都是很重要的。因为含有有机溶剂的流动相中，以pH计测定pH 精度比较低，建议先溶剂A（水溶液）中测定pH，然后再加入有机溶剂配成流动相。虽然对流动相最终的pH有些不确定的因素，但是不影响RPC的常规操作。在RPC中，一般根据以下几种性质选择缓冲液：1.pKa和缓冲容量2.溶解度3.紫外吸光率（使用紫外检测器时）4.挥发性（使用MS和蒸发光散射检测器）5.离子对试剂6.稳定性和仪器的兼容性其中，前四种最重要。1.pKa和缓冲容量；缓冲容量指的是缓冲液维持恒定pH的能力，取决于：缓冲液的pKa值；缓冲液的浓度；流动相的pH。当缓冲液中的溶质的两种形态浓度相等时，即缓冲液的pKa与流动相pH相等时，缓冲能力最大。缓冲液的pKa与流动相pH相差越大时，缓冲液的能力越小。因此，缓冲液的pKa与流动相pH相差不能超过1.0个单位（当缓冲液浓度较高时，可以放松到1.5个单位）流动相的缓冲容量一般与缓冲盐浓度成正比，通常浓度范围是5-25mmol/l。样品完全溶解在流动相中可避免在RPC分离过程中发生缓冲能力不足的问题，尤其是流动相缓冲液浓度较低或注入样品量较大时，尤为重要。下表中列举了RPC一些缓冲盐和属性：在流动相pH8，使用紫外检测器时，较多使用的缓冲盐有：磷酸盐、三氟乙酸盐、乙酸盐、甲酸盐。流动相的有效缓冲容量值得是当缓冲能力不足时，增加溶质的量并不会引起pH较大的变化。磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由於它们是二级解离，有二个pKa值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽： NaH2PO4： pKa12.12， pKa27.21Na2HPO4： pKa17.21， pKa212.32配酸性缓冲液： 用 NaH2PO4，pH14，配中性缓冲液： 用混合的两种磷酸盐，pH68，配碱性缓冲液： 用 Na2HPO4，pH1012。用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS（十二烷基硫酸钠）会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。只要流动相的pH与表7-1所示的范围相符（pH3.5；6.0pH8.5；或者pH11），磷酸盐都是不错的选择。甲酸盐和乙酸盐的pH缓冲范围是2.5-6.0，适用于210nm或者以上的检测波长，由于具有挥发性也适用于质谱检测。在低pH时才有质谱检测碱性物质，使用乙酸铵或者甲酸铵均可以提高离子强度，从而使检测高浓度样品时不会出现拖尾峰。磷酸盐、乙酸盐、甲酸盐都是在pH小于8时最常用的缓冲液。2.溶解度有机缓冲盐在所有的有机-水流动相中均具有较好的溶解想，但是无机缓冲盐在有机相笔记较高的情况下溶解度会受到限制。这会在混合溶剂A和B的混合析出沉淀，从而在柱子或者HPLC设备中造成堵塞。首先确认缓冲盐在流动相中必须完全溶解，可以混合不同比例的混合流动相静止30min观察是否产生絮状物或者沉淀。在酸性缓冲盐中，例如磷酸缓冲盐，钠盐（最难溶）钾盐铵盐（最易溶）。缓冲盐在有机相溶解顺序：四氢呋喃（最难溶）乙腈甲醇（最易溶）。3.检测器要求在7-1表中策越的提供了一些缓冲盐导致UV吸光度增加的信息。更多参看下表。在使用LC-MS时，要求缓冲盐具有挥发性。常用的缓冲盐有：三氟乙酸、乙酸、甲酸、乙酸铵、甲酸铵。