移液管和可调式移液器的使用与误差分析.ppt

生物化学基本实验技能训练 二 721E型分光光度计的原理和使用方法 医学院生物化学教研室 实验目的 1 掌握721E分光光度计的原理 结构与操作方法2 学习末知溶液的浓度测定方法3 制作CuSO4标准曲线 求得未知CuSO4溶液的浓度 主要内容 分光光度法的原理吸光度的测量定量分析方法721E分光光度计的操作方法721E分光光度计操作练习 分光光度法 问题 如何测定溶液中某一种物质的浓度 提示 酸碱滴定 氧化还原 络合滴定 沉淀等 光分析 经历了目视比色 光电比色和分光光度法几个不同阶段 分光光度法 利用溶液对单色光的吸收度来确定溶液中有色物质的含量有色物质溶液颜色的深浅与其浓度有关 浓度愈大 颜色愈深 光的基本性质 光是一种电磁波 具有波动性和微粒性 波长 频率 和光速 c 之间的关系是 c 电磁波谱图可见光区 波长范围约为380 760nm近紫外光 280 380nm 图1 1电磁波谱 物质对光的选择性吸收 问题 歌舞厅内彩色球灯旋转时 你看到物质颜色发生什么变化 结论 物质对光的吸收具有选择性 同一种物质对不同波长的光的吸收能力不同 不同物质对同一波长的光的吸收能力也不同物质所呈现的颜色正是它对不同波长光选择性吸收产生的在人视觉上的反映 溶液的颜色当白光通过某一溶液时 该溶液会选择性地吸收某些波长光而让那些未被吸收的光透射过去 溶液呈现透射光的颜色 被吸收的光与透射过去的光称为互补色光 吸收曲线以波长为横坐标 吸光度为纵坐标作图 即可得到一条吸光度随波长变化的曲线 称之为吸收曲线或吸收光谱 光吸收程度最大处的波长 称为最大吸收波长 常用 max表示 在正常情况下 选用不同浓度的某种溶液 最大吸收波长是固定不变的 应用 可作为物质定性 定量分析的依据 光吸收的基本概念 条件 一束平行单色光照射到均匀的 非散射的溶液时 I0 Ia Ir ItI0为入射光强度Ia为吸收光强度Ir为反射光强度It为透射光强度 透光率与吸光度 透光率 Transmittance T T It I0 100 透光率的变化范围 0 100 吸光度 absorbance A 透光率的负对数 又称为光密度 Opticaldensity OD A lgT lg I0 It 吸光度的变化范围 0 Lambert Beer定律 条件 单色光 稀溶液 吸光度 Absorbance 吸光系数 液层厚度 溶液浓度 Lambert Beer定律 光吸收基本定律 吸光系数是物质的特征性常数 A kLC 吸光光度法的原理吸光度的测量定量分析方法721E分光光度计的操作方法721E分光光度计操作练习 仪器结构 分光光度计 分光光度计的误差 Lambert Beer定律偏离的原因物质浓度太高 改变了被吸收光的折射率仪器的局限性入射光的波长不纯 杂散光的干扰 光电检测器的疲劳现象非对称的化学平衡因其浓度 pH 溶剂和温度的改变 发生解离 缔合 溶剂化和互变异构等化学变化而发生偏离 测量条件的选择 入射光波长一般选用被测物质溶液的 max 可以获得较高的灵敏度控制适当的吸光度测量范围最小误差出现在T 20 65 A 0 2 0 7 的范围内选择适当的参比溶液 参比溶液的选择 1 溶剂参比当被测试液 显色剂及其他试剂在测定波长处都无吸收时 可用纯溶剂 如蒸馏水 作参比溶液 2 试剂参比当被测试液无吸收 而显色剂或其他试剂在测定波长处有吸收时 可用不加试样的 试剂空白 作参比溶液 3 试样参比若被测试液本身在测定波长处有吸收 而显色剂等无吸收时 可用不加显色剂等的 试样空白 作参比溶液 吸光光度法的原理吸光度的测量定量分析方法721E分光光度计的操作方法721E分光光度计操作练习 定量分析方法 1 标准对照法根据Lambert Beer定律得 As abcsAx abcx标准对照法的优缺点 定量分析方法 2 标准曲线法配制一系列不同的已知浓度的测定物溶液 按测定管同样处理显色 分别读取各管吸光度 以浓度为横坐标 以吸光度为纵坐标 绘制标准曲线 测定时每一个浓度至少应同时做三管 平行管 取其平均值进行标准曲线的绘制 Ax Cx 测定未知溶液的吸光度 直接从标准曲线上查得测定物的浓度 标准曲线法的优缺点 定量分析方法 3 摩尔吸光系数法摩尔吸光系数 是溶液浓度为1mol L 液层厚度为1cm的吸光度 在已知 的情况下 查文献 读取测定液厚度为1cm时的吸光度 即可根据下式求得测定液的浓度 C A 摩尔吸光系数法的优缺点 吸光光度法的原理吸光度的测量定量分析方法721E分光光度计的操作方法721E分光光度计操作练习 721E分光光度计的结构 1 电源开关2 波长调节 旋纽3 方式设定键 MODE 4 100 T 0A 键5 0 T 键6 比色皿架 样品室 7 比色皿架拉杆 功能键介绍1 电源开关2 波长调节 旋纽 设置波长 360 760nm 3 MODE 键 设置测试方式 T与A4 0 T 键 将比色皿架处于 调零透射比 位置 调T为零 5 100 T 0A 键 使比色皿处于 参比样品 位 用于调整 T为100 或 A为零 6 比色皿架 插放比色皿 有4个槽位 7 拉杆 推或拉比色皿架拉杆 听到 咔嚓 声时 比色皿已置光路中 第一声 咔嚓 表示比色皿处于 参比样品 位 第二声 咔嚓 表示比色皿处于 调零透射比 仪器预热与调试 开机前 先确认仪器样品室内是否有东西挡在光路上 光路上有东西将影响仪器自检甚至造成仪器故障 1 打开电源开关 使仪器预热20分钟 2 用 波长调节 旋钮将波长设定在要使用的分析波长位置上 3 盖好样品室盖 用 方式设定 键 MODE 改变测试为透光率 T 方式 4 调 T 0 用比色皿选择拉杆使比色皿槽处于 调零透射比 位置 在T方式下 按 0 T 键 调透光率为零 5 调 T 100 推或拉比色皿架拉杆 使比色皿槽处于 参比样品 位置 按 100 T 调100 透射比 样品测试 1 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中拿放比色皿时应持其 毛面 不要接触 光面 比色皿内的溶液面高度不应低于2 5cm被测试的样品中不能有气泡和漂浮物比色皿外的液体用滤纸吸干2 打开样品室盖 将盛有溶液的比色皿分别垂直插入比色皿槽中 盖上样品室盖比色皿的 光面 要与光源在一条线上 垂直放置参比样品通常放在样品架的第一个槽位中3 调 T 100 将参比溶液推入光路中 用 MODE 键改变测试为 T 按 100 T 0A 键调整T 100或A 0仪器在自动调整过程中 显示器显示 BLA 数秒后显示100 4 调 T 0 拉比色皿架拉杆 使比色皿槽处于 调零透射比 位置 在T方式下 按 0 T 键 调T 05 重复步骤 3 和 4 至 T 100 和 T 0 不再改变 6 按 MODE 将测试方式设置为A方式7 拉比色皿架拉杆 使比色皿槽处于 样品 位 仪器自动显示该样本的吸光度 记录数据 吸光光度法的原理吸光度的测量定量分析方法721E分光光度计的操作方法721E分光光度计操作练习 721E分光光度计操作练习 已知CuSO4溶液的浓度5 测定末知CuSO4溶液的浓度方法1 制作CuSO4标准曲线 测定未知CuSO4溶液的浓度2 利用标准对照法测定 Reagents Materials 5 CuSO4X CuSO4dH2OTesttubesPipettesSpectrophotometerCuvette 实验操作 取6只试管 按右表操作混匀 在波长650nm 用蒸馏水 参比溶液 校正零点 读取各管吸光度 记入右表 方法一 以浓度为横坐标 吸光度为纵轴 绘制标准曲线 读取未知浓度CuSO4溶液的光密度 从标准曲线上查出其浓度 方法二 以任意一管为标准管 计算未知浓度CuSO4溶液的浓度 2 Cuso4 x 5ml Ax Ax Cx X CuSO4 Ax Cx 1 标准曲线法