《中国药典》三部注释模板.doc

附件2：中国药典三部注释模板1. 细菌类制品注释模板皮内注射用卡介苗2. 病毒类制品注释模板流感疫苗3. 治疗类制品注释模板1人血白蛋白4. 治疗类制品注释模板2注射用重组人干扰素1b5. 体外诊断类制品模板人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒皮内注射用卡介苗卡介苗是一种活的、减毒牛型结核分枝杆菌制成的疫苗，通过人工方法接种于人体，使未受结核菌感染的人体产生一次轻微的没有临床危险的原发感染，从而产生一定特异性免疫力，当人体再次感染自然结核菌时，可以限制细菌的生长繁殖，减少体内结核菌的数量而起到预防结核病的作用，对儿童原发性结核病、血行播散性结核病及结核性脑膜炎有显著的预防效果。1901年,法国科学家Nocard从患结核性乳腺炎的奶牛身上分离到一株强毒性牛型结核杆菌，后经法国医生卡默特（A.Calmette）和兽医介兰（C.Guerin）在含5%甘油牛胆汁的马铃薯培养基培养，发现牛型结核杆菌毒力逐渐降低，该结果于1907年发表。此后持续13年，经过230次的连续传代，在1921年动物实验结果证明这株牛型结核杆菌失去了毒力，该菌感染牛、豚鼠、小鼠、猴和家兔都不能使其发病，但能产生免疫力，该菌株达到了疫苗菌株的标准，将其制成疫苗，1921年7月1日疫苗首次应用于人类，经过几年的时间证明其预防结核病安全、有效，于1924年在全球应用推广，1928年法国召开国家科学大会为纪念卡介二氏的功劳，将该菌株制备的疫苗定名为卡介苗（bacelle Calmette Guerin BCG ）。在二十世纪五十年代前，卡介苗是通过口服途径免疫的， 由于口服卡介苗安全性与有效性都存在缺陷，而改由皮下注射、皮内注射以及皮上划痕的方法进行免疫接种，通过实践结果证实，皮下注射会引起脓肿等局部反应；而皮上划痕的方法难以保证接种的剂量。因而皮内接种卡介苗的方法得以广泛使用，其剂型也由早期的液体改为冻干，大大提高了接种的效果。 1974年BCG被纳入WHO扩大免疫计划1。至今BCG共约在172个国家、接种40亿人次，每年约1亿儿童接种BCG，是世界上接种人数最多，最安全的疫苗之一。 自原始的卡介苗菌株从巴斯德研究院供应到世界各国后，不同的实验室各自建立了传代方法，多数实验室是在土豆胆汁或土豆苏通培养基上传代与保存，这种传代方式继续应用到40年代中期，在许多地区一直应用到上世纪50、60年代。经过长期传代，在生物学特性、免疫学特性、保护效果和剩余毒力等方面产生显著差异，形成了不同卡介苗亚株。目前世界上主要的卡介苗制品的菌株分别为卡介苗巴斯德株（Pasteur 1173P2）、丹麦1331株（Danish 1331）、日本172株（Tokyo 172-1）、莫斯科株（Moscow 254） 、巴西株（Moreau）等，我国卡介苗菌株为Danish 823菌株传代培养而来，名为上海D2PB302PSII甲10菌株，是我国唯一的卡介苗生产用菌株。我国目前所用BCG为冻干皮内注射用BCG，包括10人份疫苗（含卡介菌0.40.6mg）和5人份疫苗（含卡介菌0.20.3mg）两种规格。主要用于3个月以内的婴儿或PPD皮试阴性儿童预防结核病。目前国内上市仅为5人份疫苗（0.25mg）一种规格。 制造概要1、总体工艺情况及国内外发展状况；BCG作为一种活疫苗，生产过程主要包括菌体培养、菌体收集和洗涤、菌体研磨、定量稀释等。目前，国际上BCG生产主要采用表面浮膜培养和深层培养两种技术。表面浮膜培养是最经典的方法，也是应用最广泛的方法，目前世界上有20多个国家采用该方法。我国BCG生产采用表膜培养，原液生产工艺可分为菌种接种与培养、菌液收集和研磨两个阶段，大致工艺可概略如下。启开工作种子批菌种，接种于苏通马铃薯培养基，培养一段时间，挑取发育良好的菌膜移种于改良苏通综合培养基表面（S1），37-39静止培养10-14天，连续在液体苏通培养基上培养2-3次（S2或S3），收集S2或S3菌膜制成100mg/ml菌悬液，取适量菌悬液接种入苏通培养基中（S纱），37-39培养10-14天，在液体表面逐渐形成菌膜即为纱膜。用S纱在苏通培养基上传代2-3次，成为纱膜第2代或第3代，培养8-12天的第2代或第3代纱膜可用于制备BCG。菌种自启开至最终收获物传代代数不能超过12代，每代培养结束后，应逐瓶检查，若有污染、湿膜、浑浊等情况应废弃2。收集菌膜压干后称湿重，移入盛有不锈钢珠瓶内，钢珠与菌体的比例应根据研磨机转速控制在一适宜的范围，并尽可能在低温下研磨，或用手工研磨，加入适量无致敏原稳定剂稀释成一定浓度的BCG菌体原液。对BCG原液进行纯菌检查和浓度测定，向原液中加入稳定剂，制成1mg/ml或0.5mg/ml半成品。对半成品进行纯菌检查、浓度测定、沉降率测定、活菌数测定及活力测定，然后分装冻干，即为BCG成品2，。英国、瑞士和荷兰等国采用深层培养技术制备BCG。将冻干菌种开启重溶后种入改良罗氏鸡蛋培养基表面，在罗氏培养基上至少传2代，第3代在液体Dubos培养基中深层培养，液体培养基中通常需要加Tween80或Triton WR1339。卡介菌在液体培养基中呈均匀分散的生长。然后离心收集菌体、洗涤、再离心集菌，加保护液，制成所需浓度的BCG。2、关键工艺步骤原理及控制条件；疫苗的质量安全、有效和一致性，除了依赖于对疫苗的全面检定，更重要的生产过程中科学、严格的质量控制。BCG生产过程中的质量控制主要从如下几方面进行。种子批的质量控制历史上曾因BCG生产用菌种错误出现严重不良反应的的深刻教训，严控生产用菌种十分重要。我国目前使用D2 PB302种子批作为BCG生产用菌种，严禁使用通过动物传代的菌种制造BCG。生产用菌种采用种子批系统，原始种子批样验明其记录、历史、来源、和生物学特性。从原代种子批传代、扩增后冻存保存为主种子批。从主种子批制备工作种子批。主种子批核工作种子批得各种特性应与原始种子批一致。BCG种子批生产前应作严格检定，检定合格后方可用于生产，工作种子批启开至菌体收集传代应不超过12代。主要从以下几方面进行BCG生产用种子批的质量控制。培养特性 BCG在苏通培养基上经3739培养，生长良好、抗酸染色为阳性。在苏通马铃薯培养基上培养的卡介菌应是干皱成团略呈浅黄色。在牛胆汁马铃薯培养基上为浅灰色黏膏状菌苔。在鸡蛋培养基上有突起的皱型和扩散型两类菌溶，且带浅黄色。在苏通培养基上卡介菌应浮于表面，为多皱、微带黄色的菌膜。毒力试验用结核菌素纯蛋白衍生物（TB-PPD）皮肤试验阴性、体重300400g的同性豚鼠4只，各腹腔注射1ml菌液(5mg/ml)，每周称体重，观察5周动物体重不应减轻；同时解剖检查，大网膜上可出现脓疱，肠系膜淋巴结及脾可能肿大，肝及其他脏器应无肉眼可见的病变。无有毒分枝杆菌试验 用TB-PPD皮肤试验阴性的同性豚鼠6只，于股内侧皮下各注射1ml浓度为10mgml菌液，注射后豚鼠体重不应降低，6周和3个月时分别解剖3只豚鼠，各脏器应无肉眼可见的结核病变；若有可疑病灶，应做涂片和组织切片检查，并将部分病灶磨碎，加少量生理氯化钠溶液混匀后，皮下注射2只豚鼠，若证实系结核病变，该菌种即应废弃；当试验未满3个月时，豚鼠死亡则应解剖检查，若有可疑病灶，即按上述方法进行，若证实系结核病变，该菌种应废弃；若证实属非特异性死亡，且豚鼠死亡1只以上应复试。免疫力试验用种子批菌种制备疫苗，经4只300400g豚鼠分别皮下注射0.2ml疫苗(1/10人用剂量)，对照组注射0.2ml生理氯化钠溶液。豚鼠免疫后45周，经皮下攻击103104强毒人型结核分枝杆菌，攻击后56周解剖动物，免疫组与对照组动物的病变指数及脾脏毒菌分离数的对数值应有显著差异。 菌种培养和传代中的质量控制 卡介苗作为一种减毒活疫苗，菌种的安全、可靠至关重要。首先，必须严格按照种子批管理系统，启用和保存菌种，严禁使用通过动物传代的菌种制造BCG。其次，菌种传代和培养的质量高低直接影响疫苗质量。我国BCG生产采用表膜培养技术，培养过程中，表面菌膜的质量至关重要，通常液体表面形成生长快、薄而多绉并富于弹性的菌膜，适合扩大传代。冻干菌种在马铃薯培养基上培养获得的菌种如果不能及时传代，可于2-8保存，但保存时间不得超过2个月。生产过程中，为了简化程序和降低工作量，可将传代过程中获得的纱膜移入冷藏室中保存，下次生产时可直接将纱膜接种入苏通培养基中，而不必每次生产都用马铃薯培养基获取第一代菌膜。但纱膜在冷藏室的保存时间应控制在2个月以内，并且每代纱膜均需作纯菌检查。在传代过程中，每代培养结束后，均需逐瓶检查，若有污染、湿膜、浑浊等情况应予废弃。另外，应确保菌种自启开至最终收获物传代代数不能超过12代，以保证疫苗的质量稳定。菌种培养过程中应将温度控制在37-39，培养时间也应严格控制，通常，纱膜接入液体培养基中，培养时间应控制在14-21天，液体培养基菌膜直接接入液体培养基，只需培养6-8天即可，用于制备纱膜或BCG原液的菌膜培养时间控制在8-12天。培养基的质量控制卡介苗生产用培养基为苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培养基或液体苏通培养基。通常，卡介菌培养第一代，即冻干菌种的复苏，使用苏通-马铃薯培养基或胆汁马铃薯培养基，以后各代培养均使用液体苏通培养基。其中的氮源有必要进行控制，通常将液体培养菌膜直接转接液体培养基时，待接种培养基使用谷氨酸钠作为氮源，其他各代培养多用天冬素作为氮源。原液收集和合并（菌体收集和研磨）中的质量控制培养结束后，应逐瓶检查，若有污染、湿膜、浑浊等情况应废弃。收集菌膜压干，移入盛有不锈钢珠瓶内，钢珠与菌体的比例应根据研磨机转速控制在一适宜的范围，并尽可能在低温下研磨。加入适量无致敏原稳定剂稀释，制成原液。由于水分压干程度不同，同样湿重下的疫苗所含实际活菌量不同，进而影响 疫苗浓度，故在对收集的菌膜进行压干去除水分时，压力控制是必要的，通常根据收集的菌量调整压力。同样，菌体经研磨后获得大小不一的菌团，菌团大小可能和临床上BCG的不良反应有关，通常菌团越大，越易引起局部反应并可在淋巴结处滞留而引起强反应，因此，压干的菌块移入装有不锈钢株的球瓶内，钢珠与菌体的比例应根据研磨机转速控制在适宜范围，研磨时间也应根据菌量确定。同时应对菌液均匀度进行监测，以保证生产过程的一致性。总之，在菌体收集、压干和研磨过程中中，应对压力和研磨转速及时间设计相应的过程参数并经充分验证。检定按照原液检定，半成品检定和成品检定分别进行描述，说明检定项目设定的原则、意义；1、原液检定原液检定有两个项目，分别为纯菌检查和浓度测定。纯菌检查按现行版药典无菌检查法进行，生长物做涂片镜检，不得有杂菌。纯菌试验是疫苗的安全性试验之一，保证疫苗制品不含杂菌。浓度测定用国家药品检定机构分发的1 mg/ml的冻干卡介苗参考比浊标准，以分光光度法测定原液浓度，浓度范围为60-120mg/ml。原液浓度=（样品A580nm/标准品A580nm）稀释倍数1 mg/ml。浓度测定的设定是为了确保疫苗有效成分的含量，并监测生产过程的一致性。2、半成品检定半成品检定有5个项目，分别为纯菌检查、浓度测定、沉降率测定、活菌数测定、活力测定。本成品纯菌检查同原液的纯菌检查。半成品浓度测定同原液的浓度测定，应不超过配制浓度的110%。半成品浓度=（半成品A580nm/标准品A580nm）1 mg/ml沉降率测定，可以和浓度测定同时进行，将浓度测定后的半成品室温静置2小时，再检测A580nm，计算静置前后2小时吸光度值的变化，应不大于20%。通过检测沉降率，可以了解菌液的均匀性及菌团的大小，从而控制制品的质量，同时也监测生产过程的一致性。沉降率=（半成品A580nm-2小时后的半成品A580nm）/半成品A580nm100%。活菌数测定，半成品活菌数经冻干后有显著性下降，为了保证冻干后成品的活菌数，因此每批半成品均需做冻干前活菌计数，半成品活菌数应不低于1.0107CFU/mg。活力测定，采用XTT法测定，将相同浓度的半成品与检测参考品100l/孔加入到培养板中，同时加入25lXTT与中间电子载体混合物，于37-39避光培养24小时，检测A450nm，半成品的吸光度值应大于参考品的吸光度值。卡介苗生产过程中从半成品到成品的周期较短，而常规的活菌数测定耗时长，需要4-5周时间，通过XTT法可以快速检测卡介苗活力，从而可以了解半成品中活菌含量。3、成品检定成品检定共有9个项目，除装量差异、水分测定、活菌数测定和热稳定性试，验外，按标示量加入灭菌注射用水，复溶后进行其余各项检定。生物学与物理检定每批疫苗须做抗酸染色涂片检查，抗酸染色应是抗酸杆菌,细菌形态与特性符合卡介菌特征;制品外观为白色疏松体或粉末状, 残留水分不高于3.0%,加入稀释液后，应于3分钟内完全溶解；装量差异限度为15%。安全性检定纯菌试验按现行版药典无菌检查法进行，观察14天,无污染其他杂菌。无有毒分枝杆菌试验无有毒分枝杆菌试验是卡介苗制品重要的安全性试验，因为结核杆菌其形态与培养特性与卡介苗基本一致，如果污染该菌用常规微生物方法无法区分，只能根据结核杆菌与卡介苗对豚鼠的致病力的差异加以区别。同一代菌种生产的各批冻干卡介苗应抽1个亚批做安全试验，每间隔两个月应至少抽1亚批进行毒分枝杆菌试验。用PPD皮肤试验（10IU）阴性，体重300400g的同性健康豚鼠6只，每只皮下注射相当于50人份的冻干皮内注射用卡介苗，每2周称重一次，观察6周，动物体重不应减轻；同时解剖检查每只动物，若肝、脾、肺等脏器无结核病变，该批疫苗即为合格。效力检定活菌数与热稳定性试验卡介苗的效力与其活菌数密切相关，疫苗中含有足够数量的活菌是保证疫苗免疫成功发挥预防作用的重要因素，因此活菌数试验是卡介苗制品重要的质控指标。同时卡介苗是活菌疫苗，活菌易受到环境温度的影响而导致活菌数改变，进而影响疫苗的质量，因此对制品进行热稳定性试验，以评价疫苗的稳定性。每批成品抽取5支疫苗稀释并混合后进行活菌数测定，培养4周后活菌数应在1.0106CFU/mg以上。同时取冻干后疫苗放置3728天进行加速破坏试验，测定放置后样品的活菌数，与4保存的同一批疫苗同时进行比较，计算活存的百分率。加温放置制品的活菌数应不低于冷藏疫苗的25%，并不得低于2.5105CFU/mg。活菌数与热稳定性试验可以同时进行。动物效力测定同一代菌种生产的各批冻干卡介苗应抽1个亚批做效力测定，每间隔两个月应至少抽1亚批进行效力试验。用结素试验（PPD 10IU）阴性，体重300400g的同性健康豚鼠4只，每只皮下注射0.5mg的冻干皮内注射用卡介苗，注射5周后皮内注射PPD 10IU/0.2ml，注射PPD24小时后观察结果，局部硬结反应直径应不小于5mm。PPD 试验能反应卡介苗接种后机体产生免疫反应的情况，通常情况下，只有免疫成功，才能出现PPD 反应，因此质控中的动物效力测定，是反应卡介苗制品免疫力的指标。稀释剂稀释剂为灭菌注射用水，应符合现行版药典的相关规定。4、历版药典标准变化的情况、原因及与国外要求的比较；我国皮内注射用卡介苗的质量标准是规程根据世界卫生组织卡介苗标准制定，内容涵盖了WHO卡介苗规程所有内容，但WHO标准对浓度、均匀度项目缺少有效的质控指标，对临床使用存在一定的安全隐患，尤其近年来卡介苗不良反应增加，而其是否与制品本身有关缺少依据。因此我国在2010版药典中增加半成品沉降率的质控项目，目的是为了监测生产过程的一致性，从而保证疫苗的质量。同时由于半成品至冻干的周期很短，也增加了XTT法快速检测活菌活力质控项目；正在修订的WHO 卡介苗标准在成品项下有快速检测卡介苗活菌数方法，为ATP法， 两种检测方法，目的都是为了快速了解制品中卡介苗的活菌含量。我国卡介苗质量标准与WHO规程的主要区别在是热稳定项目标准不同，我国质量标准规定加温放置制品的活菌数应由原来标准不低于冷藏疫苗的20%，提高到25%，并由不得低于2.0105CFU/mg，提高到不得低于2.5105CFU/mg。而由于不同卡介苗亚株制备的疫苗制品热稳定不同，WHO的卡介苗热稳定标准仍然为不低于冷藏疫苗的20%，并由不得低于2.0105CFU/mg。5、国内外相关标准发展变化的趋势。正在修订的WHO 卡介苗规程中包涵了以下修改内容工作种子批 （Working seed lot），规定从主代种子批尽量减少传代次数制备工作种子批，如3-4代。而我国对从主代种子批制备工作种子批未规定传代代次，实际操作中一般维持在4代内。单次收获物（Single harvests），规定从主代种子批到单次收获物传代代次不得超过12代。我国规定为从工作种子批到菌体收集传代不得超过12代。种子批检定 （Tests on seed lot），补充用分子生物学方法特异性鉴别卡介苗亚株试验。半成品浓度测定 (Test for bacterial conceration),欧洲药典中半成品无浓度检测项目，在成品中检测该项。而我国和WHO规程相似，目前标准规定在半成品项下进行浓度检测，成品不检测。成品鉴别试验（Identity test），成品鉴别试验能证明制品为卡介苗BCG ，除了用抗酸染色涂片法检查细菌的形态与特性及固体培养基菌落特点符合卡介菌特征，还可应用核酸扩增技术如PCR法来特异性的鉴别不同的卡介苗亚株。英国生物制品标准和检定研究所（NIBSC）设计了多重PCR法3，通过检测不同卡介苗的遗传学特性来特异性的鉴别卡介苗及不同的亚株。检测目标包括卡介苗基因组的缺失区RD1、 RD2、RD 8、RD 14、RD 16区及基因座SenX3-RenX3上的串联重复序列数。其中RD1是卡介苗基因组的特异缺失区，而存在于结核分枝杆菌复合群中，包括强毒的人结核分枝杆菌及牛结核分枝杆菌，通过检测RD1的存在与否即可即可特异性鉴别BCG。不同卡介亚株的RD2、RD 8、RD14、RD16区及基因座SenX3-RenX3上的串联重复序列数不同，PCR扩增后，通过凝胶电泳指纹图谱区分卡介苗与有毒分枝杆菌及不同的卡介苗亚株。不同的卡介苗亚株有不同的凝胶电泳指纹图谱3，上述多重PCR鉴别实验方法已经过包括中国在内的世界上八个独立实验室的验证，旨在替代目前的抗酸染色鉴别实验方法4。我国药典目前仍采用抗酸染色涂片法作为卡介苗鉴别试验的方法。中国食品药品检定研究院已对我国生产用卡介苗菌种的遗传性特性进行了研究，并对传代12代内的产品进行了检测。 结果显示我国卡介苗菌种缺失RD1、RD2，不缺失RD8、RD14、RD16、nRD18及RDDenmark/Glaxo，含有一个IS6110插入序列，SenX3-RenX3 基因座有3个串联重复序列5，并且在12代内都是稳定的6。我国卡介苗亚株是由Danish823传代培养而来的，和目前世界上应用较多的Danish1331亚株比较，我国卡介苗亚株不缺失RDDenmark/Glaxo，该区域是目前BCGDanish及BCG Glaxo株的特异缺失区。另外我国仅有唯一的卡介苗菌株用于生产，不同于世界上其他国家，同时使用不同的卡介苗亚株制品。因此若使用核酸扩增技术PCR法作为特异性的鉴别卡介苗的试验方法，仅采用检测RD1的存在与否及能达到特异鉴别卡介苗制品的目的。成品无有毒分枝杆菌试验， 若在半成品项检测无有毒分枝杆菌试验，且结果合格，在成品项下有可能去掉该项。我国对半成品不进行无有毒分枝杆菌试验检测，对成品进行检测。无有毒分枝杆菌试验以卡介苗免疫豚鼠后，连续观察6周，实验到期后解剖豚鼠，观察动物脏器是否有结核病变。该方法不但耗时长，而且有动物消耗，不符合节约动物原则和快速检验的需要。鉴于与结核分支杆菌H37Rv、牛型分枝杆菌相比，卡介苗基因组中缺少了编码毒力的基因，如H37Rv RD1区east6和cfp10等基因，检测毒力特异性基因是否存在即可了解分枝杆菌是否为毒性分枝杆菌。这两种基因检测一个即可。中国食品药品检定研究院卡介苗实验室拟用PCR法扩卡介苗是否存在毒力基因来替代动物法，检测指标为east6毒力基因。检测结果显示，有毒的分枝杆菌H37Rv及牛分枝杆菌存在east6基因，可扩增出320bp目的片段，而卡介苗无此基因，则无320bp的扩增条带，通过高浓度琼脂糖凝胶电泳即可以对结果进行鉴别。该方法可在12小时内完成，且用一支0.25mgBCG干粉即可完成检测，灵敏度较高。PCR方法本身的特异性及节省时间、减少动物损耗的优点，说明该方法有替代目前动物法的可能性与可行性。成品卡介苗活力检测（Test for viability），除了常规通过培养法计数卡介苗菌落形成单位（CFU）来检查卡介苗活菌数， 还可采用其他的方法快速检测卡介苗活力，包括生物发光法或其他的生化试验法。生物发光法是通过检测卡介苗活菌中三磷酸腺苷含量（ATP法）来快速检测卡介苗活力。该方法经过包括中国在内8个不同实验室的验证7， 验证结果显示，该方法可区分4与37存放4周后样品活菌数的差异，但ATP含量与活菌数相关性较差，还需要进一步验证。分析认为，只有检测出单个细菌中ATP含量，才能将该方法应用于BCG活菌含量的快速检测，目前该方法尚在进一步研究中。我国目前对半成品进行卡介苗活力快速检测，方法为XTT法，原理为活BCG 在代谢过程中，通过氧化-还原反应将四唑鎓盐（Tetrazolium salt，XTT）还原为可溶性的高色产物甲臢（Formazan），甲臢含量反映了 BCG 活菌数量。该方法操作简单，24小时可出结果，不需要特殊仪器。试验结果显示XTT 法能反应 BCG 制品中活菌的含量差异，与培养法菌落形成单位（CFU）结果有较好的相关性，可用于 BCG 活菌含量的快速检测8。对半成品进行活菌数的快速检测比对成品更有实际应用意义，因为半成品至成品的周期短，不但可以快速了解半成品中的活菌数，还可以监测生产过程的一致性。卡介苗接种是结核病预防和计划免疫工作内容之一，对预防和减少儿童结核病,特别是结核性脑膜炎、血行播散性结核病的发挥起着重要作用，但是对于青少年和成人保护效果差异较大,不同的人群和不同地区的保护力从0%80%不等,尤其是对HIV感染者无法接种卡介苗以提供保护。鉴于以上原因，国内外进行了大量结核新疫苗的研究工作，包括重组卡介苗（rBCG）、DNA疫苗、亚单位疫苗、减毒活疫苗、全菌体灭活疫苗等，希望能够替代或加强卡介苗的保护作用，但到目前为止，结核新疫苗的保护作用并未超过卡介苗，因此尽管卡介苗保护效果差、但还将继续使用，当今结核新疫苗研究方向应该是对不同的人群采用不同的疫苗和免疫策略。针对新生儿预防结核感染的免疫，可采用初免用加强型疫苗，该疫苗为替代卡介苗的新疫苗，能产生更强保护力, 以降低结核的感染率；而对于结核病高危人群的预防，可采用初免-加强（Prime- Boost）免疫策略，即初次免疫和加强免疫用不同的疫苗。如初免可用DNA疫苗或亚单位疫苗，加强免疫用BCG、不同载体的DNA疫苗或抗结核药等。此种免疫策略期望达到强于卡介苗的保护效果而预防感染。另外感染结核菌未发病者为结核潜伏感染人群，机体免疫力一旦低下，潜伏的结核杆菌复燃导致活动性结核病的发生，此类人群用疫苗，是预防已感染者发病的疫苗，是目前结核新疫苗研究的难度与热点，首先面临的是有效筛选出潜伏感染者。以结核杆菌特异性抗原为基础，发展简单、易行、价廉的筛查方法，在我国已经取得一定的进展9-10。我国是结核高负担国家之一，目前结核杆菌感染人群已有5亿，加强对新疫苗研究的投入，实施主动预防、控制已感染者发病，是结核病控制的重要途径。 参考文献：1. Hawgood BJ. Doctor Albert Calmette 1863-1933: founder of antivenomous serotherapy and of antituberculosis BCG vaccination. Toxicon, 1999; 37(9): 1241-1258.2. 国家药典委员会， 2010版 中华人民共和国药典 三部，中国医药科技出版社，2010，80-82。3. Bedwell J, Kairo SK, Behr MA, et al , Identification of substrains of BCG vaccine using multiplex PCR Vaccine,2001 Feb 28;19(15-16):2146-2651.4. Markey K, Ho MM, Choudhury B,Report of an international collaborative study to evaluate the suitability of multiplex PCR as an identity assay for different sub-strains of BCG vaccine. Vaccine. 2010 Oct 8;28(43):6964-95. 赵爱华，贾淑珍，寇丽杰，等 国内外卡介苗的分子遗传学特性,中国生物制品学杂志，2009 22(5):583-587。 6. 赵爱华，乔来艳， 贾淑珍，等 我国生产用卡介苗的传代稳定性，中国生物制品学杂志，2009 22(11):1102-1104。7. Ho MM, Markey K, Rigsby P, Report of an International collaborative study to establish the first WHO reference reagents for BCG vaccines of three different sub-strains. Vaccine. 2011 Jan 10;29(3):512-8.8. 赵爱华，贾淑珍，寇丽杰，等.应用四唑鎓盐（XTT）法快速检测卡介苗活菌含量，中国医药生物技术，2009，4（1）：33-36.9. 徐苗，陈保文，沈小兵，苏城，王国治. 重组Esat-6变态反应原对结核病的早期发现的应用价值，中国防痨杂志，2004，26（S）：36.10. 徐苗，罗永艾，黎友伦，陈保文，沈小兵，苏城，王国治.重组结核分支杆菌11kD蛋白对结核分支杆菌感染的鉴别作用，中华结核和呼吸杂志，2006，29（11）：762-765.流感病毒裂解疫苗通用名称： 流行性感冒病毒裂解疫苗英文名称：Influenza Vaciine （Split Virion）, Inactivated汉语拼音：Liugan Bingdu Liejie Yimiao流行性感冒（以下简称流感）病毒可引起急性呼吸道传染病，其危害性在于传染性强，常引起本病的流行甚至引起世界大流行。目前，接种流感疫苗是预防流感和控制其流行的最有效的措施。 国际上普遍现使用的疫苗均为纯化的灭活疫苗，包括流感全病毒灭活疫苗、流感病毒裂解疫苗、流感病毒亚单位疫苗。早期的流感病毒灭活疫苗只是有限的纯化后制成，疫苗接种后全身和局部副反应大。20世纪60年代，超速离心机和色谱技术的应用，研制出真正意义上的纯化全病毒灭活疫苗，尽管接种副反应大副降低，但对于儿童使用时仍出现不良反应。将病毒颗粒裂解后制成的纯化裂解病毒疫苗，接种副反应大大降低。20世纪70-80年代，将病毒裂解后，提纯血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）， 研制出亚单位疫苗。流感亚单位疫苗接种后虽然不良反应明显降低，但免疫原性不及流感全病毒灭活疫苗。流感减毒喷鼻疫苗已经获得美国FDA批准上市，但使用减毒活疫苗应慎重考虑使用安全的问题， 比如疫苗株病毒与野毒病毒株重配产生毒性更强的新型流感病毒，因此这种疫苗只在少数国家有限地使用。新型佐剂疫苗的研发成功提高了流感疫苗对机体的体液免疫反应和细胞免疫反应，美国已经研制成功以MF59水/油乳剂作为佐剂的新型佐剂流感疫苗。目前， 国际上正在加紧研制应用细胞培养生产流感疫苗，提高规模化生产，避免了传统的采用鸡胚技术生产流感疫苗的诸多问题。另外，核蛋白合成肽疫苗、DNA疫苗以及能够预防各种亚型流感病毒， 特别是大流感病毒感染通用流感疫苗已成为当前研究的热点。我国1979年版和1990年版生物制品规程均收载了“流行性感冒活疫苗制造及检定规程”，该制品为非经纯化的单价甲型流感减毒活病毒外用鼻喷制剂。2005年版中国药典三部开始收载“流感全病毒灭活疫苗”；2010年版中国药典三部增加收载了“流感病毒裂解疫苗”。2008年版欧洲药典（6.0版）收载了“流感全病毒疫苗（鸡胚/细胞培养）”、“流感病毒裂解疫苗”、“流感病毒亚单位疫苗（鸡胚/细胞培养）”、“流感病毒亚单位病毒体疫苗”； 2009年版英国药典收载了“流感病毒裂解疫苗”、“流感病毒亚单位疫苗”、 “流感全病毒疫苗”。2010年版美国药典（32版）收载了“流感疫苗”， 但其中内容仅为概要性的描述。 一、 制造概要 目前季节性流感疫苗生产用病毒株（包括甲型H1N1、 H3N2以及B型毒种）由世界卫生组织（WHO）流感参比研究中心推荐和提供、经国家药品管理部门批准后依据批准的生产工艺投产。WHO提供的疫苗生产病毒株均已适应于鸡胚培养，接种鸡胚后可快速大量增殖的病毒用于疫苗生产。目前，国内外现批准上市的流感疫苗均系采用传统的鸡胚培养技术生产。将各型流感病毒分别接种鸡胚尿囊腔后，在适宜的温度下培养适宜的时间， 收获含有流感病毒的鸡胚尿囊液、加入适宜浓度的甲醛灭活病毒（病毒灭活也可在纯化后进行），经纯化后，去除大量的鸡胚杂蛋白成分， 纯化后的病毒液中加入适宜的裂解剂裂解病毒， 裂解后的病毒液采用适宜的方法再次进行纯化，进一步去除鸡胚蛋白成分和流感病毒的核酸RNA等杂质。经除菌过滤后制成单价病毒原液。 将制备的三个亚型的病毒原液按标示量的血凝素含量进行混合配制后制成三价流感病毒裂解疫苗。疫苗中可含有防腐剂， 用于预防与疫苗株抗原性相同的流感病毒引起的流行性感冒。二、 制造 生产用鸡胚各型流感病毒株在种子批系统建立过程中，毒种传代必须使用来源于SPF鸡群的鸡胚， 以最大程度避免种子批制备过程中污染禽外源感染因子，特别是禽白血病病毒和禽腺病毒。由于全球SPF鸡胚的供应远不能满足生产的需要，同时，考虑到疫苗生产工艺中对流感病毒灭活的同时对鸡胚可能引入的潜在外源因子也具有灭活作用，因此，WHO相关指南规定， 流感病毒灭活疫苗的生产可使健康鸡群来源的鸡胚。目前， 国内外流感灭活疫苗生产普遍遵循这一原则。疫苗生产使用上通常选用9-11日龄的鸡胚， 此阶段胚蛋的尿囊液体积量最大、组织蛋白成分含量相对较低， 可获得更多量的病毒液。鸡胚投入生产前，每枚蛋胚都要应经过灯检筛查，挑选表面清洁无畸形、血管清晰、存活的鸡胚用于生产。由于白色鸡蛋易于进行鸡胚筛查，国内生产用鸡胚通常选择来自“海兰白”、“海兰灰”等品种的鸡群。【名称和来源】对于季节流感疫苗而言，生产用毒种通常包括甲型（H1N1、 H3N2）和乙型（B型）。 流感病毒HA抗原容易发生变异，一般说来， A型流感病毒株普遍在HA上可被保护性抗体识别的区域每年会有34个氨基酸的改变， 每25年，这些突变的积累就引起了先前一个周期的毒株的抗原漂移， 从而导致人体通过既往流感疫苗接种或自然感染后产生的免疫不能对新型流感病毒的流行产生保护，因此， WHO建立了遍布全球99个国家的128个流感实验室的全球流感监测网络，根据全球流感病毒流行情况和对流感病毒流行株抗原基因序列分析和比对，以及新型病毒在全球传播的可能性，每年提出建议，对流感疫苗生产用病毒株适时更换。WHO推荐的疫苗株是采用基因重配方式构建的毒力减弱、适合于鸡胚培养、病毒产量相对较高的毒株。WHO于每年的2月份和9月份分别向全球发布北半球、和南半球流感病毒的流行情况，推荐可用于流感疫苗生产的病毒株，并由WHO 流感参比研究中心，包括美国疾病控制与预防中心（CDC）、英国国立研究院（NIBSC）、 澳大利亚墨尔本原联邦血清实验室（TGA）和日本国立公共卫生研究院向各国生产企业提供用于季节流感疫苗生产用毒种和检定用抗原参考品和抗体参考品。对于流感疫苗株的使用，WHO指南中规定，生产用疫苗株应得到国家管理当局的批准； 美国药典规定，生产用毒株应由美国公共卫生部推荐并由国家流感专家委员会指定；在我国，生产用疫苗株应具有合法来源，明确毒株的名称、毒种来源的代次以及相关的传代背景资料等，并经国家药品管理部门的批准。 【病毒种子批的建立】建立疫苗生产用病毒种子批系统的主要目的是为了使生产的不同批次疫苗间最大限度保持质量的一致性、稳定性、可控性和可溯源性。应按照中国药典三部通则中“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的要求建立种子批系统。由于流感疫苗生产用毒株是由WHO流感病毒参比中心提供。生产企业应根据WHO流感实验室提供各型毒株的代次，相应建立主种子批和工作种子批。WHO提供各型疫苗株的代次往往不尽相同、且每年都有新的疫苗株更换，因此流感疫苗不象其他疫苗一样种子批代次相对固定，为此在2005年版药典三部中未对该品种种子批毒种规定限定代次。考虑到流感病毒在扩增复制过程中抗原容易发生改变，所以传代次数过多可能影响到毒株的抗原稳定性，因此，在满足生产需要的前提下，应尽可能使用早代的毒种用于生产。欧洲药典中规定，自批准的重配株或批准的流感病毒分离时的代次至工作种子批毒种的传代不超过15代， 生产的疫苗为自工作种子批毒种扩增1代制成。根据目前国内生产企业在获得疫苗株后建立种子批的情况，通常是将来源WHO的 疫苗株接种SPF鸡胚连续传12代建立主种子批，由主种子批毒种接种SPF鸡胚连续传12代建立工作种子批，工作种子批毒种扩增1代制备成疫苗。据此，本版药典三部明确规定，以WHO推荐并提供的流感毒株代次为基础，传代建立主种子批和工作种子批，至成品疫苗病毒总传代不得超过5代。 【种子批检定】由WHO流感实验室获得的各型流感毒株经扩增后应进行全面检定，以证明该毒株可用于疫苗的生产， 检定项目至少应包括鉴别、无菌、支原体检查、病毒滴度、血凝效价以及外源性禽白血病病毒和外源性禽腺病毒等检测， 检测合格的毒种建立主种子批。由于种子批建立均采用SPF鸡胚制备， 因此主种子批检定合格的工作种子批可不进行禽特异性外源因子的检查，包括禽白血病病毒和禽腺病毒，但至少应进行鉴别、无菌、支原体检查、病毒滴度、血凝效价等项目的检查。 1. 鉴别试验鉴别试验常用方法是血凝抑制试验。因为流感病毒颗粒表面的HA蛋白含有识别和结合宿主细胞表面受体的结构。 流感病毒的受体为含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白，一些哺乳动物和禽的红细胞表面均含有此两种成分， 能被流感病毒所识别和结合， 并发生红细胞凝集现象。如果在病毒液中加入针对流感病毒血凝素的特异性免疫血清，可抑制红细胞凝集现象的出现，通过特异性免疫血清对病毒血凝现象的抑制， 可对流感毒进行鉴别。 试验用红细胞通常为1%的鸡红细胞， 为所作试验的特异性，检测的同时做所用免疫血清对照、红细胞对照和抗原对照。鉴别试验还可采用单向免疫扩散试验（SRID）检测，即将含有一定量抗流感病毒抗体参考品的1.5%琼脂糖凝胶板上打孔， 将抗原参考品对照和供试品分别加入到相应的孔内，供试品与相应（亚）型特异性抗体参考品产生相应沉淀环，结果证明其抗原性与推荐的病毒株相一致。试验使用的抗原参考品和抗体参考品来源于WHO流感参比研究中心。2. 病毒滴度2010年版中国药典三部种子批检定中增加了病毒滴度的检测，该检测可对病毒在鸡胚中的扩增的病毒量进行检查，以评价疫苗株在鸡胚中的复制能力，同时也是有效确定生产疫苗时工作种子批的稀释依据， 可控制每枚鸡胚所接受的病毒量。采用半数鸡胚感染剂量法（EID50）检查，将毒种10倍系列稀释，每个稀释度接种10个鸡胚尿囊腔，每胚0.2ml。培养48-72小时后筛选活胚，冷胚后取尿囊液进行红细胞凝集试验，红细胞为1%的鸡红细胞。根据检测结果计算病毒滴度，应不低于6.5LgEID50/ml。3. 血凝滴度血凝滴度检测和病毒滴度检查同样可对流感病毒的复制能力进行评价，由于流感疫苗主要以血凝素含量评价做为效力指标，因此血凝效价的测定和结果对于评估疫苗生产毒种而言比病毒滴度的测定更客观、可信和重要。检测方法是取毒种进行系列稀释（一般为10倍系列稀释），将每个稀释度的病毒液与等量的 1鸡红细胞悬液混合于2025放置60分钟，观察红细胞凝集相，以病毒最高稀释度为判定终点，血凝效价应不低于1：160。4. 特异性禽外源因子检查包括禽白血病病毒和禽腺病毒检测。将供试品与分别相应（亚）型的流感病毒特异性性免疫血清中和后，接种敏感细胞，经培养后采用酶联免疫法或血清学方法进行检查， 结果应为阴性。【毒种保存】一般情况下，主种子批毒种应冻干于20以下长期保存， 以保证种子批的性状稳定。一旦第二年WHO公布的流感疫苗株的一株或几株不变更，则该冻干毒种由于已经过全部检定并经前一年疫苗生产的实践验证为安全有效，可重新制备工作种子批用于当年流感疫苗的生产， 无需重新向WHO索取相应的疫苗株。但如果不考虑该因素，由于流感疫苗生产用毒种经常更换，可能来年的毒种与今年完全不一致，因此主种子批毒种也不一定需要冻干，制备的液体主种子批保存于60以下也不失为明智之举。工作种子批由于使用量较大，且往往当年使用，则一般均以液体毒种经检定符合规定后60以下冻存。 【单价病毒原液】单价病毒原液制备的主要工艺步骤包括：将毒种接种鸡胚尿囊腔、 培养、病毒收获、纯化，灭活、裂解、再纯化等组成。1. 病毒接种、培养为保证生产工艺的一致性，生产企业应当依据本企业制备的各型流感病毒工作种子批的病毒滴度，根据每一鸡胚应接种的病毒量和体积计算，稀释成每ml单位内的病毒滴度，并应遵守同一工作种子批以同一病毒量接种鸡胚。由于疫苗生产使用健康鸡群来源的鸡胚， 因此疫苗生产工艺过程无法保证完全无菌状态，为最大限度控制培养过程中的微生物的污染，毒种稀释液中可加入最低有效抑菌浓度的抗生素。对于在毒种稀释液中使用抗生素的，应按2010年版中国药典三部的有关规定进行检测，生产工艺其他阶段不得加入任何抗生素。 稀释后的毒种接种鸡胚尿囊腔，我国生产企业现行接种鸡胚的工艺有机械全自动或人工接种两种方式，病毒接种的关键在于接种部位的正确性，应当正确接种在尿囊腔中，如接种不正确而破坏尿囊腔可导致鸡胚死亡。每胚接种病毒液0.2ml， 通常情况下，于3335oC 下进行培养， 由于不同型别的病毒在鸡胚中的复制能力不同，因此培养时间亦有差异，不同型别的流感病毒培养时间一般约为4872小时。 2. 尿囊液收获培养到期后，经灯检筛选活的鸡胚置2-8 oC 过夜或16小时左右冷胚后开始收获尿囊液,冷胚的目的是使鸡胚减少活动度并使鸡胚遇冷后血管收缩，易于收集尿囊液。目前收获方式由机械全自动、 半自动以及人工收获不同方法。使用机械化自动收获尿囊液的量较人工收获方法高。严格剔除死胚和控制收获器具的消毒是有效降低尿囊液细菌内毒素含量的关键。每个收集容器中的尿囊液应逐一取样进行检定。3. 尿囊收获液检定31 微生物限度鉴于流感疫苗采用健康鸡群来源的鸡胚生产， 生产工艺中间产物容易污染细菌， 为最大程度降低有此造成的潜在风险， 生产工艺的各中间环节进行应有效控制微生物的污染程度，加强污染的监控。鉴于此，2010年版中国药典三部新增了尿囊收获液检定，包括微生物限度检查以及特定病原微生物检查。微生物限度检查可采用2010年版药典三部附录的“微生物限度检查法”中“细菌、 霉菌及酵母菌计数”法检查， 即用将适当稀释的供试品接种到适宜的培养基上培养，培养到期后进行菌落计数并根据供试品稀释倍数计算出供试品中的总菌数。也可以采用其他适宜的检测方法作为辅助方法，对尿囊液的污染程度进行有效的控制。鸡胚中污染沙门氏菌， 将对人体产生潜在的危害， 因此，对于沙门氏菌等致病菌应进行特异性检测。本版中国药典三部“微生物限度检查”中“控制菌检查法”中， 载明了采用培养基与生化反应培养结合的方式检测沙门氏菌。 在充分验证方法一致性的前提下， 也可采用经批准的沙门氏菌检测试剂盒进行快速筛查。 4. 病毒灭活由于收获的尿囊液不可避免地存在一定数量的微生物污染，因此， 尿囊液收获后应尽快采用有效的灭活工艺进行病毒灭活，尽可能降低或不增加尿囊液中微生物载荷。 （1）病毒灭活剂可采用甲醛或-丙内酯，目前， 国内批准上市的均采用甲醛作为灭活剂。甲醛对病毒核酸和病毒蛋白质都有破坏作用，蛋白质含量对限定甲醛浓度的灭活效果至关重要， 所以病毒灭活应在工艺验证规定的蛋白质含量范围内进行。在控制蛋白质含量的检测方法上， 国内生产企业通常采用Lowry法检测蛋白质含量，国外有些生产企业采用更为便捷的分光光度法控制中间产物的蛋白质含量， 检测波长为280nm的吸收值， 因蛋白质在280nm处有最大的吸收峰， 以此作为蛋白质含量监测的参考指标， 以保证灭活工艺的稳定性。（2）WHO指南和欧洲药典中均规定病毒灭活工艺应在2-8下进行。国内企业病毒灭活一般采用一步法灭活， 灭活温度通常为2-8； 国外有的企业采用二步法灭活工艺， 即在2-8冷灭活一定时间后， 再于25放置一定时间进行热灭活。 对于甲醛灭活剂的浓度， 欧洲药典规定， 且生产工艺任何阶段加入的灭活剂的浓度不得超过200ug/ml； WHO指南规定甲醛使用浓度不超过400 ug/ml；为控制甲醛对病毒抗原性的影响， 本版中国药典三部规定的甲醛终浓度不高于200g/ml； 对于病毒灭活时间， 国内外均没有统一的要求， 应根据各生产企业的生产工艺和验证结果进行确定， 并按照批准的病毒灭活时间执行。（3）国内现批准的流感病毒裂解疫苗病毒灭活工艺可在不同工艺阶段进行，有些企业的标准是在尿囊液收获后立即进行病毒灭活， 有些是在病毒纯化后灭活。国外生产企业的病毒灭活工艺都是在病毒纯化后进行，避免了尿囊液中含有大量的组织蛋白，影响甲醛对病毒的作用； 同时， 纯化后的尿囊液中极大部分杂蛋白被有效去除，且经过超滤浓缩后病毒液体积大大降低，可减少病毒灭活验证试验检测样品的数量，抽样检测的结果更具有代表性； 另外， 纯化工艺一定程度上可降低尿囊液中污染的微生物数量，因此， 从工艺优化的角度讲，病毒灭活工艺在纯化