荧光免疫技术.ppt

荧光免疫技术 彭晓东 概念 荧光免疫技术 fluoroimmunoassay 将免疫学反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一种方法 荧光抗体技术 fluorescentantibodytechnique 以荧光物质标记抗体进行抗原定位的技术 特点 直观定位性快速 敏感 传统荧光抗体技术的基本原理 光源荧光素 Ab Ag荧光素 Ab Ag荧光显微镜观察 荧光的基础知识荧光抗体的制备免疫荧光显微技术在医学检验中的应用 主要内容 荧光的基础知识 荧光某些物质受到一定波长光激发后 在极短时间内发射出波长大于激发光波长的光 荧光产生机制吸收并储存能量一些化学物质基态激发态发光 发射光谱指固定激发光波长 在不同波长下所记录到的样品发射荧光的强度 激发光谱指固定检测波长 用不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度 荧光效率发射荧光的光量子数 荧光强度 荧光效率 吸收光的光量子数 激发光强度 荧光寿命指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰减到一定程度时所用的时间 荧光的猝灭指荧光物质的荧光辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会发生减弱的现象 荧光偏振FH FLP FH FLP 0说明完全不偏振 1 P 1为部分偏振 荧光物质 其他荧光物质 镧系螯合物如Eu3 等酶作用后产生荧光的物质如 4甲基伞酮 D半乳糖苷 半乳糖苷酶4甲基伞酮 荧光免疫分析常用的仪器和设备 荧光显微镜荧光分光光度计流式细胞仪 荧光显微镜 光源高压汞灯 氙灯或卤素灯紫外光 UV系统 UG 兰紫光 BV系统 BG 透射光落射光 光路 激发光类型 滤板隔热滤板 能阻断红外线的透过而隔热 激发滤板 提供合适的激发光谱 BG只允许325 500nm波段通过 最大透光度在410nm 吸收滤板 滤除激发光而只允许荧光通过 透光范围410 650nm 有OG 橙黄色 和GG 淡绿黄色 两种 荧光抗体的制备 荧光抗体荧光素与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成 荧光抗体的制备 一 抗体与荧光素的结合二 标记抗体的纯化三 荧光抗体的鉴定 一 抗体与荧光素的结合 对抗体的要求 1用于标记的抗体 是高特异性和高亲和力的 2所用抗血清中不应含有针对标本中正常组织的抗体 3一般需经纯化提取IgG后再作标记 作为标记的荧光素应符合以下要求 1具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团 与蛋白质结合后不易解离 而未结合的色素及其降解产物易于清除 2荧光效率高 与蛋白质结合后 仍能保持高的荧光效率 3荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明 4与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫学性质 与蛋白质的结合物稳定 易于保存 5标记方法简单 安全无毒 抗体标记荧光素常用方法 1 搅拌法待标记蛋白缓慢滴加荧光素室温持续搅拌4 6小时离心上清即为标记物 该法适用于标记体积较大 蛋白含量较高的抗体溶液 优点 标记时间短 荧光素用量少 缺点 本法的影响因素多 若操作不当会引起较强的非特异性荧光染色 2 透析法适用于标记量少 蛋白含量低的抗体溶液 特点 标记较均匀 非特异性染色也较低 蛋白质 荧光素缓冲液 荧光素标记蛋白质 PBS 影响荧光素与抗体结合的因素 1PH值 常用PH7 4 8磷酸缓冲液及PH9 9 5碳酸盐缓冲液 2温度 常用20 25 大于25 有猝灭作用 3荧光素与蛋白的浓度比例 最适为1 100 1 1504猝灭剂的影响 二 标记抗体的纯化 目的去除未结合的游离荧光素去除过度标记的蛋白去除非特异反应抗体 方法透析法将标记物置于透析袋中透析 适用于蛋白含量低的标记物凝胶过滤法常用SephadexG50凝胶 洗脱第一峰为结合蛋白峰 第二峰为荧光素峰 离子交换层析法依次洗脱下来的成分是未结合荧光素的抗体 荧光标记合适的抗体 过量结合荧光素的抗体 肝粉吸收法用于去除交叉反应抗体或非期望抗体等非特异反应抗体 三 荧光抗体的鉴定 1 抗体效价抗体效价可用琼脂双扩法进行滴定 效价大于1 16较为理想 2 荧光素与蛋白质的结合比率 F P 将制备的荧光抗体稀释至A280 1 0 分别测读A280 蛋白质特异性吸收峰 和标记荧光素的特异吸收峰 按公式计算 F P值越高 说明抗体分子上结合的荧光素越多 反之越少 一般用于固定标本的荧光抗体以F P 1 5为宜 用于活细胞染色的以F P 2 4为宜 FITC F P 2 87 A495A280 0 35 A495 RB200 F P A515A280 免疫荧光显微技术 基本原理 荧光抗体 抗原 组织或细胞 荧光显微镜观察 一 标本的制作 常见临床标本 组织 细胞 细菌制作成的标本 切片 涂片 印片 要求 保持抗原的完整性 保持抗原的定位性 标本切片尽量薄 以利于抗原抗体充分接触以及镜检 尽量除去影响抗原抗体反应的物质 标本的固定 目的 1 防止细胞或切片从玻片上脱落 2 除去组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质 3 易于保存 试剂95 乙醇 甲醇 丙酮 10 福尔马林等 二 荧光抗体染色 目的 使荧光抗体与待观察的抗原结合 达到示踪效果 步骤 于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体 25 37 湿盒反应30分钟 用PBS洗涤 缓冲甘油封片 直接法 间接法 三 荧光显微镜检查 选择好光源和滤光片FITC可选用激发滤光片BG12与吸收滤光片OG4或GG9 RB200可选用BG12与OG5配合 荧光染色法结果判断 免疫荧