2动物细胞培养大实验.ppt

实验三细胞培养用液的配制 动物细胞在体内靠组织液维持生存 在体外培养就需要培养基 以供给细胞所需营养 调控细胞生长增殖 保证细胞能够正常代谢 天然培养基 早期细胞培养以血浆 血清 胎汁 淋巴液等组织液为培养基 费用高 效果不稳定 人工培养基 根据已知细胞所需物质的种类 数量配制的培养液 缺乏细胞的分裂激素 生长因子 需添加一定量的血清 M199DMEMMEMRPMI1640 由于不同来源血清存在不同的生物学效应及细胞生长的不稳定性 目前仍期待无血清培养基 培养用液 1 平衡盐溶液 BSS 无机盐组成 维持细胞渗透压 调控培养液的酸碱平衡 HanksD HanksPBSTyrodeEarle 2 细胞消化液 胰蛋白酶溶液 原代培养时解离组织块儿 传代培养时使贴壁细胞脱离培养器皿表面 3 抗生素溶液 SP 青霉素加链霉素溶液 防止微生物污染 Hanks a 将CaCl2加入约100ml水中溶解 b 其它成分依次加入约200ml水中溶解 c 将a缓慢加入b并不时搅动 d 加入少许酚红呈桃红色 定容至500ml 过滤除菌分装于两个大储液瓶 封口 4 冰箱保存 1 3 5组配制 D Hanks 各成分依次加入约200ml水中溶解 加入少许酚红呈桃红色 定容至500ml待用 2 4 6组配制 一 BSS配方 g 500ml 及配制方法 二 消化液的配制方法 三 SP的配制方法 四 M199配制方法 取胰蛋白酶0 125g溶解于约40mlD Hanks 定容至50ml 过滤分装于8个青瓶 封 存 取16ml超纯水溶入160万单位青霉素 留10ml稀释到50ml 再溶入100万单位链霉素 混匀备用 在约150ml水中加入M1991 96g NaHCO30 44g hepes0 24g S P 2ml 定容至200ml 过滤分装于2个小储液瓶 封 存 注意 每组上交8个青瓶及8个胶盖 集中分装血清待用 实验四消毒灭菌及无菌操作 细胞培养的每个环节都应该严格进行无菌操作 防止细菌 真菌和病毒污染 一 灭菌方法 1 物理灭菌 紫外线消毒 高压湿热消毒 过滤除菌 2 化学消毒 75 乙醇 火焰杀菌 0 2 的新吉尔灭 3 抗生素消毒 青霉素链霉素 二 无菌操作 1 无菌室消毒 新吉尔灭擦拭 紫外线照射 20 30分钟 2 洗手 着装 新吉尔灭洗手 擦洗用具外部 穿戴无菌服 帽 口罩 4 超净工作台 3 火焰烧灼 剪 镊 瓶口 瓶盖 吸管口适度过火烧 无菌区 单向过滤风 注意事项 1 不同药品用不同的药匙取 少量多取 出瓶药不放回 2 操作要准确 敏捷 但不能太快 3 笔记等用具不能带入无菌室4 出进无菌室严防空气对流 5 工作台上的用品布局要合理 6 不能触及器皿的无菌部位 一旦触及要更换或用火焰烧灼 7 烧过的用具待冷却再用 8 培养用液不要过早开盖儿 不要长时间直立暴露瓶口 9 不同用液不要用一支吸管吸取 10 用过的用具清洗后放回储存柜 不准丢失 Hanks a 将CaCl2加入约100ml水中溶解 b 其它成分依次加入约200ml水中溶解 c 将a缓慢加入b并不时搅动 d 加入少许酚红呈桃红色 定容至500ml 过滤除菌分装于两个大储液瓶 封口 4 冰箱保存 D Hanks 分依次加入200ml水中溶解 加入少许酚红呈桃红色 定容至500ml待用 一 BSS配方 g 500ml 及配制方法 二 消化液的配制方法 三 SP的配制方法 四 M199配制方法 取胰蛋白酶0 125g溶解于约40mlD Hanks 定容至50ml 过滤分装于8个青瓶 封 存 取16ml超纯水溶入160万单位青霉素 留10ml稀释到50ml 再溶入100万单位链霉素