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文档简介

一 实验目的 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作了解电泳技术的一般原理 二 实验原理 任何一种物质的质点 由于其本身在溶液中的解离或由于其表面对其他带电质点的吸附 会在电场中向一定的电极移动 如氨基酸 蛋白质 酶 核酸等及其衍生物质都具有许多可解离的酸性或碱性基团 它们在溶液中会解离而带电 一般在碱性溶液中 即溶液的pH值大于等电点pI 分子带负电荷 在电场中向正极移动 而在酸性溶液中 分子带正电荷 在电场中向负极移动 移动的速度取决于带电的多少和分子的大小 泳动度 不同质点在同一电场中的泳动速度不同 常用泳动度或迁移率来表示 泳动度指带电质点在单位电场强度下的泳动速度 vd tdlu cm2 V 1 S 1 EV lVt 影响泳动度因素 带电质点的性质质点所带净电荷的量 质点的大小及质点的形状 一般说来质点所带净电荷越多 质点直径越小 越接近球形 则在电场中的泳动速度越快 反之则越慢 溶液的粘度电场强度溶液的pH值溶液的离子强度固体支持物的电渗现象 本实验用醋酸纤维薄膜 是纤维素的羟基乙酸化所形成的纤维纤维素醋酸酯 具有泡沫状的结构 厚度均为120um 有很强的渗透性 对分子移动阻力很小 三 器材与试剂 醋酸纤维薄膜2 8cm常压电泳仪点样器 用盖玻片代替 培养皿玻璃板粗滤纸电泳槽巴比妥缓冲液 pH8 6 离子强度0 07巴比妥2 76g 巴比妥钠15 45g 加水至1000ml 每个大组500ml 染色液每个大组200ml氨基黑10B0 25g 甲醇50ml 冰醋酸10ml 水40ml 可重复使用 漂洗液每个组100ml含甲醇或乙醇45ml 冰醋酸5ml 水50ml透明液每个组200ml含无水乙醇 冰醋酸 7 3 本实验不做定量不用配 四 操作方法 1 薄膜准备 用镊子取醋酸薄膜一张 放在绥冲液中浸泡20分钟 识别光泽面与无光泽面 并在有光泽面一角做记号 2 制造滤纸桥 剪取双层合适尺寸滤纸桥附在电泳槽支架上 使其一端与支架的前沿对齐 另一端浸入电极槽的缓冲液中 用缓冲液润湿并驱赶气泡 使滤纸紧贴在支架上 如图 3 点样 取出膜条 用双层滤纸吸干多余的液体 平铺在玻璃板上 无光泽面朝上 用点样器蘸取血清在膜条的一端1 5cm处 均匀划一条线 4 电泳 在两电极槽内加入等高的缓冲液 将膜条平悬于滤纸桥上 点样端靠近负极 盖严电泳室通电 电压120V 电流0 4 0 7mA cm膜宽 电泳60分钟 5 染色 电泳完毕后 取膜条放在染色液中浸泡10分钟左右 6 漂洗 漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止 可得色带清晰的图谱 保存 7 透明 将干燥的电泳图谱放入透明液中浸泡2 3分钟后取出贴于洁净的玻璃板上 干后放在两层滤纸中保存 8 计算 计算出每条蛋白的泳动度 注意事项 手尽量不要接触膜条 用点
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