GST亲和层析介质使用说明书.doc

精品文档GST亲和层析介质使用说明书一、 简介 GST亲和层析介质（GST Agarose）是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质，一步分离就可得到高纯度的GST融合目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的活性。 本产品是自主设计合成的GST琼脂糖凝胶，具有优良的物理和化学稳定性，使用寿命长，操作方便，批次重复性好，易于放大，是研发与生产的理想选择。二、 性能参数特点基团密度高，载量大基质6%的交联琼脂糖凝胶吸附载量15mg GST融合蛋白（55kDa）/ml介质平均粒径100m最大流速300cm/hpH范围310，在位清洗时pH范围可到211使用温度常温保存温度+48保存液体20%乙醇化学稳定性室温下可在0.1M柠檬酸(pH 4.0)，0.1 M NaOH，70%乙醇或6M盐酸胍中耐受2h，蛋白结合能力不受影响三、 适用范围 分离谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白。四、 操作说明1. 缓冲液配制 缓冲液A（平衡缓冲液）：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，调节pH值至8.0。 缓冲液B（洗脱缓冲液）：10mM Glutathione（还原型），50mM Tris-HCl，调节pH值至8.0。因Glutathione易氧 化，需现用现配。（注：各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45 m滤膜过滤备用)。2. 样品预处理：按每克湿重菌体/25ml平衡缓冲液的比例充分悬浮离心收集的菌体；600w功率，每循环超声3s，冷却3s，循环993次,破碎菌体；4、15000rpm离心15m，收集上清液，或用0.45m滤膜过滤。3.装柱： 聚苯乙烯层析柱1)将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡。2)打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片11.5cm高度时封闭下端出口，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。3)从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫片与介质接触面滞留气泡（如对实验结果要求不严，也可不放入上垫片，以提高流速）。4)在使用一段时间后，如果层析柱流速减慢，可先用小镊子沿边缘将垫片推翻，夹出垫片，倒出介质，清洗或更换新的垫片后，按2）、3）所述 玻璃层析柱1)将层析柱洗净后垂直固定到铁架台上；向柱中加入蒸馏水，排开柱子中的空气，在蒸馏水排尽以前，关闭柱子出口，在柱内保留58cm高度的蒸馏水。 2)先将介质混匀，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。3)从上端管口将转换杆出液端缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免转换杆与介质接触面间滞留气泡。4)在使用一段时间后，如果流速减慢，可先卸下上转换杆，将介质倒出，再取出下转换接头中滤网，清洗或更换后重新装柱。4.过柱：1) 用10倍介质体积缓冲液A过柱，平衡介质；2) 上样；3)用510倍介质体积缓冲液A过柱，洗去层析柱中剩余上样液并重新平衡介质；4)用510倍介质体积缓冲液B洗脱，收集洗脱液； 5)用510倍介质体积缓冲液A重新平衡介质。注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速保持在0.5ml/min为宜。5. 介质清洗 如果在使用一段时间后，介质因表面沉积过多杂质导致蛋白结合能力下降，需对介质进行清洗。步骤如下：1) 沉淀或变性物质的清洗：用2倍介质体积6 M盐酸胍清洗，然后用5倍介质体积缓冲液A平衡介质。2) 疏水缔合物质的清洗：用34倍介质体积70%乙醇 (或2倍介质体积去垢剂，如 1% Triton X-100) 清洗介质；然后用5倍介质体积缓冲液A平衡介质。6.介质再生每次层析前，为达到最佳纯化效果，需对介质进行再生，步骤如下：1) 2倍介质体积高pH缓冲液（0.1M Tris-HCl, 0.5M NaCl, pH8.5）和低pH缓冲液（0.1M sodium acetate, 0.5M NaCl, pH4.5）交替洗脱三次。2)10倍介质体积缓冲液A平衡介质。7.SDS-PAGE检测： 1)不同浓度SDS-PAGE分离胶分离范围 分离胶浓度分离范围6%50150kD8%3090kD10%2080kD12%1260kD 15%1040kD2)SDS-PAGE操作流程 A.每个胶孔最适蛋白上样量为510g。 B.将含510g蛋白的样品溶液与loading buffer混匀，90孵育5min，取出后5000rpm离心1 min。C.上样，15mA、30mA恒流或80V、120V恒压电泳。8.介质保存48条件下，介质可长期保存于20%乙醇中。五、 GST Agarose分离GST融合蛋白实例 层析介质：GST 1ml；对照GST介质（国际领先品牌）1ml 样品：表达可溶性GST-tag融合thioredoxin的大肠杆菌BL21裂解液 结合缓冲液：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，pH 8.0 洗脱缓冲液：10 mM Glutathione（还原型）, 50 mM Tris-HCl, pH8.0 流速：GST 1ml，0.5ml/min；对照GST介质1ml，0.5ml/min实验结果：色谱分析结果见图1，色谱各组分的SDS-PAGE结果见图2。图1 GST Agarose分离GST融合蛋白色谱图1.低分子量Marker；2.上样液；3.GST-流穿液；4.GST-洗脱液；5.对照-流穿液；6.对照-洗脱液1 2 3 4 5 6图2 纯化后SDS-PAGE图六、GST亲和层析介质使用注意事项1. GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为获得最大结合量，需要保证足够的作用时间，因而在上样时要维持较低流速。在样品中加入510mM DTT可以增加介质对目标蛋白的吸附。对于按常规步骤操作吸附效果不好的样品，可以先把介质和样品混合，轻轻振摇24h，再装柱，用平衡缓冲液进行重新平衡、洗脱等操作。2. 不同的GST融合蛋白取得最佳纯化效果所需还原型谷胱甘肽浓度、洗脱体积和洗脱时间可能有所不同。必要时需对流穿液、洗脱液进行SDS-PAGE以及Western杂交分析，以确定最佳纯化条件。3.GST融合蛋白以包涵体形式存在时不能与介质结合，必须先进行变性、复性、透析处理后才能用介质进行纯化。纯化效果取决于复性效率。4.纯化后出现杂带的常见原因1)目标蛋白断裂或酶解解决方案：向缓冲液A和缓冲液B中加入1mM PMSF抑制蛋白酶活性，或0.1TritonX-100或0.1Tween-20等稳定剂。2)GST融合蛋白不完全表达GST融合蛋白有时候只表达到GST部分就终止，GST标签蛋白连同完全表达的融合蛋白均能与介质结合并被洗脱下来，因而洗脱液中出现26KD左右的杂带。解决方案：尝试用不同浓度的还原型谷胱甘肽洗脱；优化表达条件，降低GST融合蛋白不完全表达量；改变外源基因在载体中插入的酶切位点，重新构建表达载体；在不改变外源基因两端酶切位点的情况下，更换通用载体。5.如后续实验需要除去洗脱液中还原型谷胱甘肽，可采用超滤或透析的方法。七、GST标签切除GST标签可用位点专一的蛋白酶如凝血酶或Xa因子从融合蛋白中切除。蛋白酶解后，再用GST亲和层析方法去除GST标签，目标蛋白存在于流出液中。一般情况下，与切除GST标签