海洋灾害调查规范第3部分：海洋生态灾害调查（征求意见稿）.doc

HY T 1 ICS 备案号 中华人民共和国海洋行业标准 HY HY T 海洋灾害调查技术规程 海洋灾害调查规 范 第 3 部分 海洋生态灾害调查 征求意见稿 发布 实施 国国家家海海洋洋局局 发 发布布 HY T I 目 次 目 次 I 前 言 IV 1 范围 15 2 规范性引用文件 15 3 术语和定义 12 4 小型浮游生物的测定 显微镜个体计数法 3 4 1 技术要求 3 4 2 调查要素 4 4 3 采样 4 4 4 样品分析 56 4 5 资料整理 6 4 6 填写统计表 7 4 7 绘制分布图 7 5 赤潮甲藻孢囊检测 光镜法 7 5 1 调查内容 7 5 2 调查方法 7 5 3 样品采集 78 6 赤潮毒素检测 9 6 1 麻痹贝毒的检验 ELISA 法 9 6 2 腹泻性贝毒的检验 ELISA 法 11 6 3 神经性贝毒的检验 ELISA 法 14 6 4 记忆缺失性贝毒的检验 ELISA 法 16 7 弧菌总数的测定 平板计数法 18 7 1 原理 18 7 2 试剂和培养基的配制 18 7 3 仪器设备 19 7 4 样品采集 19 7 5 测定步骤 20 7 6 记录与计算 2221 7 7 注意事项 2221 8 肠球菌的测定 MPN 法 22 8 1 原理 22 8 2 仪器设备 22 8 3 样品采集 22 8 4 培养基及稀释液 22 8 5 检测步骤 23 8 6 结果表征 24 8 7 检测报告 25 9 海水中甲肝病毒的检验 PCR 法 25 HY T II 9 1 原理 25 9 2 试剂配制 25 9 3 仪器设备 2625 9 4 样品采集及处理 26 9 5 RNA 提取 26 9 6 引物的设计 26 9 7 反转录 26 9 8 PCR 扩增 26 9 9 结果判定 26 9 10 记录 26 10 海水中诺如病毒的检验 PCR 法 2726 10 1 原理 2726 10 2 试剂配制 2726 10 3 仪器设备 27 10 4 样品采集及处理 27 10 5 RNA 提取 27 10 6 引物的设计 27 10 7 反转录 2827 10 8 PCR 扩增 28 10 9 结果判定 28 10 10 记录 28 11 鱼类虹彩病毒的检验 PCR 法 28 11 1 方法原理 28 11 2 试剂及其配制 28 11 3 仪器及设备 28 11 4 分析步骤 28 12 海洋贝类体内帕金虫检验 雷氏液体巯基醋酸盐培养基培养检测 2928 12 1 方法原理 2928 12 2 主要试剂和培养基的配制 29 12 3 主要器材 29 12 4 检测流程 29 12 5 PCR 检测 3029 12 6 帕金虫具体种类的测定 31 13 海洋贝类体内单孢子虫检验 32 13 1 方法原理 32 13 2 主要试剂及其配制 32 13 3 主要仪器及耗材 3332 13 4 检测流程 3332 14 虾类桃拉病毒的检验 PCR 法 34 14 1 方法原理 34 14 2 试剂及其配制 34 14 3 仪器及设备 34 14 4 试验方法 34 14 5 结果判定 35 14 6 记录 35 HY T III 15 虾类白斑病毒的检验 PCR 法 35 15 1 方法原理 35 15 2 试剂及其配制 35 15 3 仪器设备 36 15 4 试验方法 36 15 5 结果判定 37 15 6 记录 37 附录 A 规范性附录 小型浮游生物海上采样记录表 38 附录 B 规范性附录 甲藻孢囊数量计数记录表 45405 附录 C 规范性附录 弧菌平板计数记录表 46416 附录 D 规范性附录 甲肝病毒记录表 47427 附录 E 规范性附录 诺如病毒记录表 48438 附录 F 规范性附录 鱼类虹彩病毒检测记录 49449 附录 G 规范性附录 单孢子虫检测实验记录表 504550 附录 H 规范性附录 虾类桃拉病毒检测记录表 524752 附录 I 规范性附录 虾类白斑病毒检测记录表 534853 HY T IV 前 言 HY T 海洋灾害调查技术规程 分为四个部分 第 1 部分 海洋环境灾害调查 第 2 部分 海岸带地质灾害调查 第 3 部分 海洋生态灾害调查 第 4 部分 滨海湿地退化和人为灾害调查 本部分为 HY T 的第 3 部分 本部分的附录A 附录B 附录C 附录D 附录E 附录F 附录G 附录H 附录I为规 范性附录 本部分由国家海洋环境监测中心提出 本部分由全国海洋标准化技术委员会 SAC TC283 归口 本部分起草单位 国家海洋环境监测中心 本部分主要起草人 HY T 5 海洋灾害调查技术规程 第 3 部分 海洋生态灾害调查 1 范围 本标准规定了海洋赤潮 病原生物和外来海洋生物调查的一般规定 技术要求和调查 测定 要素 以及样品采集 分析与资料整理的基本要求和方法 本标准适用于海洋灾害调查工作中的赤潮 病原生物和外来海洋生物的调查 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件 其随后 所有的修改单 不包括勘误的内容 或修订版均不适用于本标准 然而 鼓励根据本标准达成协 议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件 其最新版本适用于本 标准 GB3097 海水水质标准 GB18421 2001 海洋生物质量 GB12763 2 1991 海洋调查规范 第2部分 水文观测 GB12763 3 1991 海洋调查规范 第3部分 气象观测 GB12763 6 1991 海洋调查规范 第6部分 生物调查 GB17378 1 1998 海洋监测规范 第1部分 总则 GB17378 2 1998 海洋监测规范 第2部分 数据处理与分析质量控制 GB17378 3 1998 海洋监测规范 第3部分 样品采集 贮存与运输 GB17378 4 1998 海洋监测规范 第 4 部分 海水分析 GB17378 5 1998 海洋监测规范 第 5 部分 沉积物分析 GB17378 6 1998 海洋监测规范 第 6 部分 生物体分析 GB17378 7 1998 海洋监测规范 第7 部分 近海污染生态调查和生物调查 ISO 3951 1989 取样步骤和站位布设 ISO 5667 1 1980 水质 取样 第一部分 取样方法设计手册 ISO 5667 2 1991 水质 取样 第二部分 取样技术手册 ISO 5667 3 1994 水质 取样 第三部分 样品的保存与处理手册 ISO 8199 1988 水质 微生物培养物的计数指南 ISO IEC导则2 1996 标准化和相关活动 一般词汇 HY T 069 2005 赤潮监测技术规程 ISO 7899 1 Water quality Detection and enumeration of intestinal enterococci in surface and waste water Part 1 Miniaturized method Most Probable Number by inocuLation in liquid medium OIE Office International des epizooties Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals 2003 Centre for Research on Introduced marine pests Revised Protocols for Baseline Port Surveys for Introduced marine species Survey design Sampling protocols and Specimen handling 2001 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 HY T 6 3 1 浮游生物 plankton 是指缺乏发达的运动器官 没有或只有微弱的运动能力 悬浮在水层中 常随水流移动的生 物群 3 2 赤潮毒素 HABs toxins 有害藻华毒素 赤潮毒素是由有毒赤潮生物产生的有毒天然有机化合物 危害较大的几种毒素是麻痹性贝毒 PSP 腹泄性贝毒 DSP 神经性贝毒 NSP 失忆性贝毒 ASP 等 3 3 麻痹性贝类毒素 paralytic shellfish poisoning PSP 化学结构以石房蛤毒素 Saxitoxin 为代表的 摄食后可产生麻痹作用的存在于贝类体内的 海洋生物毒性物质的总称 3 4 腹泻性贝类毒素 diarrhetic shellfish poisoning DSP 化学结构以软海绵酸 Okadaic acid OA 为代表的 摄食后可产生腹泻作用的存在于贝类 体内的海洋生物毒性物质的总称 3 5 神经性性贝类毒素 neurotoxic shellfish poisoning NSP 化学结构以短裸甲藻毒素为代表的一类存在于贝类体内的海洋生物毒性物质的总称 3 6 记忆缺失性贝类毒素 amnesic shellfish poisoning ASP 化学结构以软骨藻酸 Domoic Acid DA 为代表的 摄食后引起一段时间内丧失部分记忆 的存在于贝类体内的海洋生物毒性物质的总称 3 7 灭菌 sterilization 用理化方法杀死一定物质中的微生物的微生物学基本技术 3 8 稀释度 dilution 试液被稀释的程度 倍数 3 9 无菌操作 aseptic technique 用于防止微生物进入人体组织或其它无菌范围的操作技术称为无菌操作 3 10 培养基 culture medium 供微生物生长繁殖所需要的各种营养物质的人工制品 3 11 平板 皿 计数 plate count 根据细菌在平板培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的 也就是 说一个菌落即代表一个单细胞 3 12 菌落 colony 单个微生物在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度 形成肉眼可见有一定形态结 HY T 7 构的子细胞的群落 3 13 肠球菌 intestinal enterococci 可在含乙酸铊 萘啶酮酸和 2 3 5 三甲基氯化四氮唑 TTC 的液体培养基中生长 可以 水解 4 甲基伞型酮酰 葡萄糖苷 MUD 44 下好氧培养的微生物 4 小型浮游生物的测定 显微镜个体计数法 4 1 技术要求 4 1 1 采水 4 1 1 1 采水量 水深大于 200m 的海区 每次采水不少于 1000cm3 水深小于 200m 的海区不少 于 500cm3 发生富营养化或赤潮海区视具体情况而定 一般每次采水 100cm3 4 1 1 2 采水层次 见表 1 具体层次视不同调查项目的要求确定 若需要详细了解其垂直分 布 可按表层 3 5 10 15 20 30m 和底层等层次采样 表 1 采水层次 测站水深范围 米 标准层次 米 底层与相邻标准 层的最小距离 米 10表层 中层 底层2 50表层 10 30 底层 2 5 表层指海面下 0 5m 深度以内的水层 水深小于 50m 时 底层为离底不足 2m 的水层 水 深在 50 200m 时 底层离底的距离为不足水深的 5 可根据调查的特殊需要 酌情增加 200m 以深的采水层次 条件许可时 应充分考虑跃层和采集叶绿素次表层最大值所处的水层 水温调查确定了温跃层以后 在温跃层区增加一个水层 4 1 2 垂直拖网 详细分析小型浮游生物种类组成时采用拖网自海地至水面垂直拖网采样 水深大于 200m 的 海区拖网深度为 200m 水深小于 200m 的海区拖网深度从底至表 4 1 3 垂直分段拖网 若需了解其垂直分布 可作垂直分层拖网 根据测站深度规定采集水层如表 2 表 2 小型浮游生物垂直分段拖网采样水层 测站水深 米 采样水层 米 200 10 0 20 10 30 20 50 30 100 50 200 100 4 1 4 连续观测时间与次数 水深小于50m的海区每3h采样一次 共采9次 水深大于50m的海区每4h采样一次 共采7次 4 1 5 种类鉴定与计数 HY T 8 除需作特殊处理的生物种类以及培养观察的特殊类群之外 鉴定到种的标本比例应在80 以 上 鉴定到属的比例应在90 以上 水采样品每次实际标本镜检数不少于100 200个 网采样品每 次实际标本镜检数不少于500个 4 2 调查要素 调查要素包括小型浮游生物的种类组成 优势种和数量分布 时间 空间 4 3 采样 4 3 1 采样仪器设备 4 3 1 1 采水器 采水器容积可为 2 5dm3 5dm3或 10dm3 4 3 1 2 网具 网具根据调查海区情况和采样对象选用 见表 3 表 3 各种网具的规格及适用对象 序 号 网具名称 网长 cm 网口内 径 cm 网口面 积 m2 筛绢规格 孔径近似值 mm 适用范围及采集对象 1小型浮游生物网280370 1 JF 62 0 077 JP 80 0 077 适用于30m 以深垂直或分 段采集小型浮游生物 2 浅水 型浮游 生物网 140370 1 JF 62 0 077 JP 80 0 077 适用于30m 以浅垂直或分 段采集小型浮游生物 3 手拖定性浮游 植物网 60220 038 NY20HC 0 020 NY10HC 0 010 用以小型和微型浮游生物 的种类组成分析以及藻种 的分离 筛绢规格见GB 2014 4 3 1 3 网底管 浮游生物网收集标本的装置 网底管套的筛绢必须与网衣筛绢的规格相同 4 3 1 4 网口流量计 使用前应经过标定 每航次标定一次 使用时安装于网口半径的中点 通过水流驱动其叶轮 转动 记录器记录转数 标定方法是将流量计按实际使用时的位置 安装在不带网衣的网圈上 并按实际采样时的拖 网速度从一定深度 10m 或 30m 垂直拖至表层 记录其转数 如此反复 5 次 10 次 取得平均 值 再计算每转的流量 此值至少保留三位有效数字 4 3 1 5 量角器 角弧形量角器 4 3 1 6 沉锤 根据水流速度和风浪大小 使用重量为10kg 40kg的铅制沉锤 4 3 1 7 绞车及钢丝绳 绞车变速范围为0 3m s 1m s 并附有排缆装置和钢丝绳计数器 钢丝绳直径为 3 6mm 5 0mm 4 3 1 8 吊杆 高度为5m 6m 深水拖网须大于6m 负荷为500kg 1000kg 吊杆的舷间距1m左右 并能调 节位置 4 3 1 9 冲水设备 水泵 水管 水桶和吸水球等 用于冲喷收集粘贴在网衣或网底管套筛绢上的标本 4 3 1 10 闭锁器 HY T 9 垂直分层拖网采集时 控制浮游生物网网口关闭装置 4 3 2 采样前的准备 4 3 2 1 根据调查要素 站数 层次计算采样数量 配以足量的样品瓶 采样工具 相应的固 定剂 记录表及其它器材 装箱上船并放于适当位置 避免碰撞和丢失 4 3 2 2 固定液 配置以下固定液 a 鲁哥氏液 Lugol s solution 100g 碘化钾溶于 1dm3蒸馏水 加入 50g 碘使其溶解 再加入 100cm3冰醋酸 b 缓冲甲醛溶液 商用甲醛 40 加入同量蒸馏水 1dm320 的甲醛溶液加 100g 六次甲 基四胺 4 3 3 海上采样与样品保存 4 3 3 1 采水 使用采水器按预定水层和规定量采集小型浮游生物标本 并装入标本瓶 样品用鲁哥氏液或 缓冲甲醛溶液固定 加入量分别为样品体积的1 和5 视样品实际浓度可作适当增减 并记录于 表A 1 4 3 3 2 垂直拖网采样 垂直拖网采样主要采集水柱中个体小于 200 m 的绝大部分小型浮游生物样品 如无壳纤毛 虫 砂壳纤毛虫 轮虫 桡足类幼体 放射虫和有孔虫等样品 按不同水深选用小型浮游生物网或浅水 III 型浮游生物网进行垂直拖网 每次下网前应检查 网具是否破损 发现破损应及时修补或更换网具 检查网底管和流量计是否处于正常状态 并把 流量计指针拨至零 放网入水 当网口贴近水面时 须调整计数器指针于零的位置 落网速度为 0 5m s 以钢丝绳保持紧直为准 当网具接近海底时 绞车应减速 当沉锤着底 钢丝绳出现松 弛时 应立即停车 记下绳长 网具到达海底后立即起网 起网速度为 0 5m s 0 8m s 网口未 露出水面前不可停车 把网升至适当高度 用冲水设备自上而下反复冲洗网衣外表面 切勿使冲 洗的海水进入网口 使粘附于网上的标本集中于网底管内 将网收入甲板 开启网底管活门 把标本装入标本瓶 样品用缓冲甲醛溶液固定 加入量为样品体积的 5 根据样品的实际浓度 可作适当增减 并记录于表 A 1 用手拖定性浮游植物网进行水平 可在网口三根网绳的接合点加一个使锤 或垂直拖网 样品用鲁哥氏液或缓冲甲醛溶液固定 如需对样品做电镜观察分析 则选用戊二醛固定 根据样品浓度可加入样品体积的 2 5 4 3 3 3 分层垂直拖网 应在网具上安装闭锁器 按规定层次逐一采样 下网时按垂直拖网方法 网具降至预定采样 水层下界时应立即起网 当网具将达采样水层上界时 应减慢速度 提前打下使锤 当钢丝绳出 现瞬间松弛或震动时 说明网已关闭 按垂直拖网方法收集固定标本 分层采样情况记录于表 A 2 4 3 3 4 注意事项 遇倾角超过45 应加重沉锤重新采样 遇网口刮船底或海底 应重新采样 4 4 样品分析 4 4 1 主要仪器和设备 光学显微镜 倒置显微镜 沉降器 滤器 支架 抽滤瓶 手持泵或真空泵 4 4 2 样品编号 各类样品应有总编号 总编号由代表采样海区 采样方式 使用网型 采样年份和样品序号 等内容的代号依次组成 每份贮存样品的瓶外须贴有总编号的外标签 瓶内应放有总编号 站号 和采样日期等内容的内标签 填写表3A 3 HY T 10 4 4 3 样品分类鉴定 标本鉴定宜采用活体与固定样品相结合 网采与水采样品相结合的方法 定量计数应以采水 样品为准 水柱的定量计数以网采样品为准 网采样品可作为种类组成分析的补充和某些个体大 于拖网筛绢孔径的种类的定量计数 4 4 4 丰度测定 4 4 4 1 沉降计数法 用于采水样品小型浮游生物计数 见附录1 2 1 计数结果记录于附表A 4 4 4 4 2 浓缩计数法 用于网采或采水样品小型浮游生物计数 见附录1 2 2 计数结果记录于附表A 5 4 4 4 3 直接计数法 适于赤潮发生期间或小型浮游生物细胞数量达每升105个以上时 用于网采或采水样品小型浮 游生物计数 见附录1 2 2 计数结果记录于附表A 5 4 5 资料整理 4 5 1 丰度计算 采水和网采小型浮游生物数量分别以cells dm3和cells m3表示 4 5 2 光学显微镜计算 4 5 2 1 a 沉降计数法计算 1 i V i N C 式中 C 单位体积海水中标本总量 单位为个每毫升 cells cm3 Ni 三个分样计数的标本总个数 单位为个 cells Vi 三个分样的总体积 单位为毫升 cm3 4 5 2 2 b 浓缩计数法计算 网采样品 2 n VV Vn C 2 1 式中 C 单位体积海水中标本总量 单位为个每立方米 cells m3 n 取样计数个数 单位为个 cells V1 水样浓缩后的体积 单位为毫升 cm3 V2 滤水量 单位为立方米 m3 Vn 取样计数的体积 单位为毫升 cm3 采水样品 3 2 1 n VV Vn C 式中 C 单位体积海水中标本总量 单位为个每升 cells dm3 n 取样计数个数 单位为个 cells HY T 11 V1 水样浓缩后的体积 单位为毫升 cm3 V2 原采水量 单位为升 dm3 Vn 取样计数的体积 单位为毫升 cm3 4 5 2 3 c 直接计数法计算 与浓缩计数法计算类同 4 6 填写统计表 a 按要求将上述统计分析数据填入相应的表格中 b 按分类系统和种类出现季节 将上述各种表格数据汇总于附表A 6和附表A 7 4 7 绘制分布图 用Surfer绘图软件绘制细胞丰度平面分布图 绘制方法如下 a 绘制小型浮游生物细胞丰度平面分布图 一般用等值线表示 取值标准如下 小型浮游 生物细胞数量 网采样品单位为 104cells m3 采水样品单位为102cells dm3 5 10 50 100 500 1 000 5 000 10 000 b 绘制小型浮游生物优势种丰度平面分布图 一般用等值线表 取值标准如下 小型浮游 生物优势种细胞数量 网采样品单位为 104cells m3 采水样品单位为 102cells dm3 1 5 10 50 100 500 1 000 5 000 c 以上取值标准 可视具体情况酌情增减 5 赤潮甲藻孢囊检测 光镜法 5 1 调查内容 5 1 1 生物调查 鉴定沉积物中藻类的孢囊 测定密度和生物量 分析其相对丰度和群落多样性 5 1 2 环境调查 环境特点海区的地理环境 形态和沉积物等 水文气象天气状况 水温 水深 沉积物粒 度 有机质 底温 5 2 调查方法 5 2 1 调查准备 调查之前 应了解调查水域的基本状况 制定调查方案 调查水域的基本状况包括沿岸的海 岸工程 海区的沉积物类型等 5 2 2 站位布设 站位的布设应根据监控区的位置和分布 结合海区的水文 水质 沉积物底质的环境资料综 合考虑 应尽量避免在粒径大的砂底布设站位 5 2 3 调查类型和次数 基线 背景 调查 宜每月一次 按生物季节 春3 5月 夏6 8月 秋9 11月 冬12 2月 宜一年调查4次 监测性调查 根据各地实情和需要 选择若干固定月分和若干站点定期取样分析 应急调查 若遇赤潮等 应跟踪监测 5 2 4 取样面积 次数和手段 在水深10米以内的港湾中或无动力设备的小船上 采泥样宜使用0 05m2采泥器 每站取1次 水深10米以上 或水流较大的海域 可用0 lm2 采泥器 每站取1次 5 3 样品采集 5 3 1 采集工具和设备 5 3 1 1 采泥器 HY T 12 曙光采泥器 两瓣的张口面积为0 lm2 深水500m 以上采泥时 应换上带重锤的挂钩 并在 两额瓣的外面附加配重 以增加采泥器的重量 大洋一50 型采泥器 取样面积为0 05m 适于无动力设备的小船在内湾取样 日产TFO重力采泥器 适用于风平浪静的浅水内湾沉积物的采集 5 3 1 2 其它工具 需要配备钢板尺 100mL白色塑料瓶 平铲 保温箱 冰袋 5 3 1 3 甲板设备 绞车 吊杆绞车和吊杆的负荷应能满足采泥的需要 吊杆宜装在主甲板后部 高出船舷5m左 右 舷间距约lm 可作回转运动 专用于采泥器取样的绞车及吊杆应能负荷500kg 吊杆高出船 舷的程度应尽量减小 以能使用为度 钢丝绳拖网一般可用直径8 10mm的软质钢丝绳 其长度按调查海区的水深确定 备有足够用 量 在专供采泥用的绞车上 宜用直径4 6mm的软质钢丝绳 在钢丝绳与采泥器相连接处应装有 转环 以防操作过程钢丝绳扭曲或打结 5 3 2 样品采集和处理 5 3 2 1 采泥样 5 3 2 1 1 曙光采泥器的操作 曙光彩泥器的操作按以下步骤操作 a 投放 将采泥器活门上的铁链挂在挂钩上 慢慢开动绞车 提升采泥器 随着钢丝绳拉 紧 两9瓣自动张开 采泥器上升到略超过船舷时 即转动吊杆将其送出舷外 待稳定后 慢速下降 入水后再快速下降 放出的钢丝绳可稍长于水深 在浅海采样时 当放出的 钢丝绳松弛时 即采泥器已着底 应立即停车 以防钢丝绳打结 在深水采样时 可根 据钢丝绳倾角的大小 加适当的余量 b 提升 开始用慢速 离底后改用快中速 接近水面时 再用慢速 当采泥器超过船舷时 应立即停车 转动吊杆使之移近船舷或用铁钩将其钩入舷内 再慢慢下降 将采泥器放 在一个预先准备好的白铁盘中 将领瓣打开 使沉积物完整的落到白铁盘中 5 3 2 1 2 大洋采泥器的操作 大洋采泥器的投放和提升与曙光采泥器相同 5 3 2 1 3 TFO 采泥器的操作 在第二部分钢管中放一根有机玻璃管 和第一 第二 第三依次拧紧 然后将钢球从第三部 分上面放下去 将第四部分也拧上 然后将绳子系上 将采泥器垂直落下 插入水中 将采泥器 轻轻拿起 并保持垂直向上 以免搅动表层沉积物 将一个橡胶塞从尖头部分塞入有机玻璃 将 其末端堵住 拧开采泥器尖头部分 并将橡胶塞用力塞紧 小心垂直取出玻璃管 观察玻璃管上 端应有一段水柱 否则重采 玻璃管上端也用橡胶塞堵住 写好标签 用锡纸将整个管包好 以 免阳光照射 冷藏存于实验室中 5 3 2 2 样品收集 保存 表层沉积物分析时 用钢板尺由沉积物表层向下量出3cm 然后用平铲将表层3cm的泥样铲 下 然后分装到6个样品瓶中 分别用于水含量的测定 孢囊的鉴别及计数 备用样的保存 样 品要装到样品瓶的2 3以上 样品瓶为100g装 样品瓶随后放到低温冷藏箱内 避光保存 低 温运回到实验室后 在4 冰箱 冷藏保存2年以上 柱状沉积物分析时 以2cm为高度单位分装入样品瓶中 分别标记为0 2cm 2 4cm 4 6cm 样品瓶随后放到低温冷藏箱内 避光保存 低温运回到实验室后 在4 冰箱 冷藏保 存2年以上 5 3 3 室内标本处理 5 3 3 1 标本核对 HY T 13 检查全部标本编号 数量等与海上记录表的内容是否相符 遇有不符 应及时查找 5 3 3 2 孢囊样品分离 称取一定量 10g 的待分析的沉积物 在培养皿中用海水稀释 倒入烧杯中 超声波处 理30s 然后倒入80 m网筛 收集过滤液 并聚集于20 m网筛中 将20 m目网筛中的残留物质 转至凸底表面皿中 加海水于皿中 用洗瓶中过滤海水喷射残留物使水流环行 孢囊和其它轻物 质悬浮 重物质沉于皿底 将上浮的悬浮液倒入烧杯中 然后再清洗皿中的残留物数次 倒入烧 杯中 然后将烧杯超声波10s左右 再经过20 m筛绢过滤 将残留在筛绢上的孢囊冲洗到带刻度 的离心管中 定容到5mL 样品在过滤前后都应尽量保存在黑暗 低温 4 的条件下 5 3 3 3 孢囊的观察及鉴定 按标本序号顺序鉴定标本 并按表B 1各项测定和填写 利用光学显微镜观察孢囊的形态结 构 根据孢囊形状 表面突起 细胞壁结构 个体颜色 副板块结构和萌发孔等特征对孢囊的种 类进行鉴定 对主要种应尽可能鉴定到种 对形态观察难以确定的种类 需要进行萌发试验 以 确定分类地位 定量观察时 吸取0 1mL 0 5mL已处理过的样品至1mL方格计数框中 重复观 察数次 使每个样品至少观察到200个孢囊 重复几次后平均 再乘以体积 除以泥样的重量 干重 得出单位泥样 干重 中孢囊的数量 5 3 3 4 孢囊的萌发培养 取1mL已处理过的孢囊样品 均匀后倒在1mL计数框上 在倒置显微镜下 用微细管挑取所 需孢囊在细胞培养板的每孔加入适量的f 2培养液 可根据不同需要选用不同的培养液 每孔放一 个孢囊 周围用密封带封闭 避免蒸发 把培养板置于 20 1 或其它适宜温度下 恒温 培养箱 光周期为12h 12h或其它比例 培养条件可根据不同种类和生态类型进行选择 每天观 察萌发情况 6 赤潮毒素检测 6 1 麻痹贝毒的检验 ELISA 法 6 1 1 原理 本方法的测定原理是竞争性酶联免疫吸附试验反应 将已知抗原吸附在固相载体表面 洗除 未吸附抗原 加入一定量抗体与待测样品 含有抗原 提取液的混合液 竞争温育后 在固相载体 表面形成抗原 抗体复合物 洗除多余抗体成分 然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物 与吸附在固体表面的抗原 抗体复合物相结合 再加入酶的底物 在酶的催化作用下 底物发生 降解反应 产生有色产物 通过酶标检测仪 测出酶底物的降解量 从而推知被测样品中的抗原 量 6 1 2 试剂和材料 除另有规所有化学试剂均为分析纯 水为蒸馏水或同等纯度的水 6 1 2 1 0 1mol L 盐酸 6 1 2 2 5mol L 盐酸 6 1 2 3 标准物质浓缩液 经酸化 含有 20 的乙醇作为保护剂 冷冻时 无限期稳定 6 1 2 4 抗体浓缩液 6 1 2 5 抗原 PSP 与载体蛋白 卵清蛋白 OVA 的结合物 6 1 2 6 兔抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物 酶标二抗 6 1 2 7 ELISA 包被缓冲液为 pH9 6 的碳酸盐缓冲液 称取 1 59g 碳酸钠 Na2CO3 2 93g 碳酸 氢钠 NaHCO3 加水稀释至 1000mL 在 4 冰箱保存 6 1 2 8 1 PVA PBS 1g 聚乙烯醇 PVA 溶于 100mLPBS 缓冲溶液中 HY T 14 6 1 2 9 洗液为含 0 05 吐温 20 的 pH7 4 的磷酸盐缓冲液 简称为 PBS T 配制方法为 称取磷 酸二氢钠 KH2PO4 2H20 0 3g 磷酸氢二钠 Na2HPO4 12H20 1 13g 氯化钠 NaCl 8 0g 吐温 20 0 5mL 加水至 1000mL 6 1 2 10 底物液 A 称取磷酸氢二钠 Na2HPO4 12H20 4 6g 柠檬酸 C6H8O7 H2O 2 55g 过氧化脲 CH6N2O3 0 25g 加水至 500 mL 即可 6 1 2 11 底物液 B 称取 3 3 5 5 四甲基联苯胺 TMB 0 125 g 溶于 2 5 mL 二甲 亚砜中 乙二胺四乙酸二钠 EDTA 2Na 0 075g 柠檬酸 C6H8O7 H2O 0 525g 加水至 500 mL 即可 6 1 2 12 底物液 将底物液 A 与底物液 B1 1 比例混合即可 6 1 2 13 反应终止液 2M 硫酸 6 1 2 14 PH 7 4 的磷酸盐缓冲液 称取磷酸二氢钠 KH2PO4 2H20 0 3g 磷酸氢二 Na2HPO4 12H20 1 13g 氯化钠 NaCl 8 0g 加水至 1000mL 用于稀释标准及样品 6 1 3 商业化试剂盒若测定低限 回收率达到本标准的要求 则也适用于本标准 6 1 3 仪器和设备 6 1 3 1 酶标检测仪 6 1 3 2 96 孔酶标板 6 1 3 3 均质器 6 1 3 4 离心机 6 1 3 5 电动振荡器 6 1 3 6 微量加样器 50 L 100 L 500 L 6 1 3 7 0 45 m 微孔滤膜 6 1 4 测定步骤 6 1 4 1 贝类分析样品的采集 分析样品的采集应有充分的代表性 依受检贝类品种决定样品的采集量 每种去壳肉量应达 到 200g 新鲜贝类不能及时送检 样品应保存在阴凉避光之处及冷藏保存 备检 6 1 4 2 试样制备 不同样品的制备程序如下 a 贝类试样制备 用清水将贝壳外表彻底洗净 除去贝壳 用双蒸水拎洗贝肉 除去泥沙 及其他外来物 收集约 200g 肉置于筛中沥水 5min 不要使肉堆积 拣出碎壳等杂物 将贝肉均质 称取 10g 均质后的样品加入 0 1mol L 的盐酸 10mL 如果样品为较干燥的 贝肉 可加入 20mL 0 1mol L 盐酸 稀释系数等同 水浴煮沸并搅拌 5min 冷却至室 温 4 下 3500r min 离心 10min 离心后可能有悬浊 不影响结果 离心后控制 pH 值 用 5mol L 的盐酸溶液调节到 4 0 以下 取 100 L 上清液 用 pH 7 4 的磷酸盐缓冲液 稀释到 10mL 1000 倍稀释 取 50 L 进行酶联免疫测定 此时的稀释倍数为 2000 倍 b 藻类试样制备 准确记取预检藻类细胞数量 3000r min 离心 10min 弃上清后向内加入 0 1mol L 的盐酸 10mL 充分搅匀 调 PH 为 3 4 采用超声破碎或机械研磨技术破碎藻 类细胞 再次离心 用 0 45 m 微孔滤膜过滤上清液 滤液置于试管内 水浴煮沸并搅拌 5min 冷却至室温 再调 PH 值到 4 0 以下 后用 0 1mol L 的盐酸定容至 15mL 该溶液 即为 PSP 提取液 根据海藻试样中 PSP 的含量用 PH 7 4 的磷酸盐缓冲液适当稀释 取 50 L 进行酶联免疫测定 c 海水试样制备 收集 2mL 待检海水样品至试管中 为了防止 PSP 在玻璃管内壁残留 立 即添加 0 5mL 海水预处理液 混匀 将该液体作为海水试样进行检测 6 1 4 3 ELISA 检测 ELISA 检测步骤如下 HY T 15 a 用 PSP OVA 2 g mL 包被酶标板 每孔 100 L 4 过夜 b 弃去残液 用洗液洗 96 孔酶标板 3 次 每次 60s 后 用 1 PVA PBS 溶液封闭 每孔 300 L 37 恒温 3h 4 保存待用 c 酶标板用 PBS T 洗 3 次 每次 60s 后 加入不同浓度的 PSP 标准溶液 制作标准曲线 或 样品提取液与抗体溶液的混合液 1 1 每孔 100 L 置 37 1h d 酶标板洗 3 次 每次 3min 后 加入酶标二抗 每孔 100 L 37 40min e 同上述洗涤后 加入底物溶液 每孔 100 L 37 13min f 用 0 5mol L 硫酸溶液终止反应 每孔 50 L 450nm 波长处测定吸光度值 6 1 5 结果的计算和表述 6 1 5 1 计算百分比吸光度值 计算 PSP 毒素标准液和样液的平均吸光度值 按式 4 分别求得每个 PSP 标准液和样液的 百分比吸光度值 4 100 0 S S A 式中 A 吸光度值的百分比 S 6 个适当的 PSP 标准液和样液的平均吸光度值 S0 0 g kg的 PSP 标准液的平均吸光度值 6 1 5 2 绘制校正曲线 以百分比吸光度值 算数级 为纵坐标 以 PSP 溶液浓度 g kg 对数级 为横坐标 绘 制出 PSP 标准液百分比吸光度值与 PSP 溶液浓度的校正曲线 每次试验均应重新绘制校正曲线 6 1 5 3 结果的计算 在 6 1 5 2 绘制的校正曲线上读取样液百分比吸光度值所对应的 PSP 浓度为试样中 PSP 的 含量 g kg 从校正曲线读出的浓度值应乘以相对应的稀释系数 6 1 5 4 结果的表述 当测定值小于 50 g kg 时 报告 PSP 的含量为小于 50 g kg 当测定值大于等于 50 g kg 时 报告 PSP 的实际测定值 6 1 6 测定低限 回收率 6 1 6 1 测定低限 本方法的测定低限为 50 g kg 6 1 6 2 回收率 本方法的回收率约为 90 6 1 7 健康和安全 PSP 含量值大于 800 g kg 国际惯例表示方式为 80 g 100g 的样品被认为是有害的 对人 类食用不安全 注 PSP 含量值 800 g kg 的国际惯例表示方式为 80 g 100g 标准液含有 PSP 应小心操作 避免接触 反应终止液为 2mol L 硫酸 避免接触皮肤 6 1 8 注意事项 所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡 再依次用自来水 蒸馏水冲洗 6 2 腹泻性贝毒的检验 ELISA 法 6 2 1 原理 本方法的测定原理是竞争性酶联免疫吸附试验反应 将已知抗原吸附在固相载体表面 洗除 HY T 16 未吸附抗原 加入一定量抗体与待测样品 含有抗原 提取液的混合液 竞争温育后 在固相载体 表面形成抗原 抗体复合物 洗除多余抗体成分 后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物 与吸附在固体表面的抗原 抗体复合物相结合 再加入酶的底物 在酶的催化作用下 底物发生 降解反应 产生有色产物 通过酶标检测仪 测出酶底物的降解量 从而推知被测样品中的抗原 量 6 2 2 试剂和材料 除另有规所有化学试剂均为分析纯 水为蒸馏水或同等纯度的水 6 2 2 1 甲醇 6 2 2 2 标准物质浓缩液 经酸化 含有 20 的乙醇作为保护剂 冷冻时 无限期稳定 6 2 2 3 抗体浓缩液 6 2 2 4 抗原 腹泻性贝毒与载体蛋白 卵清蛋白 OVA 的结合物 DSP OVA 6 2 2 5 兔抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物 酶标二抗 6 2 2 6 ELISA 包被缓冲液为 pH9 6 的碳酸盐缓冲液 称取 1 59g 碳酸钠 Na2CO3 2 93g 碳酸 氢钠 NaHCO3 加水稀释至 1000mL 在 4 冰箱保存 6 2 2 7 1 PVA PBS 1g 聚乙烯醇 PVA 溶于 100mLPBS 缓冲溶液中 6 2 2 8 洗液为含 0 05 吐温 20 的 pH7 4 的磷酸盐缓冲液 简称为 PBS T 配制方法为 称取磷 酸二氢钠 KH2PO4 2H20 0 3g 磷酸氢二钠 Na2HPO4 12H20 1 13g 氯化钠 NaCl 8 0g 吐温 20 0 5mL 加水至 1000mL 6 2 2 9 底物液 A 称取磷酸氢二钠 Na2HPO4 12H20 4 6g 柠檬酸 C6H8O7 H2O 2 55g 过氧化脲 CH6N2O3 0 25g 加水至 500 mL 即可 6 2 2 10 底物液 B 称取 3 3 5 5 四甲基联苯胺 TMB 0 125 g 溶于 2 5 mL 二甲 亚砜中 乙二胺四乙酸二钠 EDTA 2Na 0 075g 柠檬酸 C6H8O7 H2O 0 525g 加水至 500 mL 即可 6 2 2 11 底物液 将底物液 A 与底物液 B1 1 比例混合即可 6 2 2 12 反应终止液 2M 硫酸 6 2 2 13 商业化试剂盒若测定低限 或满足国内外限量要求 回收率达到本标准的要求 则 也适用于本标准 6 2 3 仪器和设备 6 2 3 1 酶标检测仪 6 2 3 2 96 孔酶标板 6 2 3 3 均质器 6 2 3 4 离心机 6 2 3 5 电动振荡器 6 2 3 6 微量加样器 50 L 100 L 500 L 6 2 3 7 0 45 m 微孔滤膜 6 2 4 测定步骤 6 2 4 1 贝类分析样品的采集 分析样品的采集要有充分的代表性 依受检贝类品种决定样品的采集量 但每种去壳肉量应 达到 200 新鲜贝类不能及时送检 样品应保存在阴凉避光之处及冷藏保存 备检 6 2 4 2 试样制备 6 2 4 2 1 贝类试样制备 贝类式样制备步骤如下 a 用清水将贝壳外表彻底洗净 除去贝壳 用双蒸水拎洗贝肉 除去泥沙及其他外来物 收集约 200g 肉置于筛中沥水 5min 不要使肉堆积 拣出碎壳等杂物 将贝肉均质 HY T 17 b 称取 2g 均质后的样品加入 8mL 80 的甲醇 甲醇 80 蒸馏水 20 4 下 3500g 离心 10min 收集上清液 c 加 8mL 80 的甲醇 甲醇 80 蒸馏水 20 到上步骤中的残留贝类在组织中再离心 4 下 3500g 离心 10min 收集上清液 加入到上步骤中收集到的上清液中 d 重复步骤三 待收集的上清液达到 20mL 时 用 0 45 m 的滤膜过滤 e 取 100 L 滤液 用蒸馏水稀释到 10mL 100 倍稀释 取 50 L 进行酶联免疫测定 此时 的稀释倍数为 1000 倍 6 2 4 2 2 藻类试样制备 准确记取预检藻类细胞数量 3000r min 离心 10min 弃上清后采用超声破碎或机械研磨技 术破碎藻类细胞 向内加入 10mL 80 的甲醇 甲醇 80 蒸馏水 20 再次离心 用 0 45 m 微孔 滤膜过滤上清液 滤液置于试管内 用 80 的甲醇定容至 20mL 该溶液即为 DSP 提取液 根据 海藻试样中 DSP 的含量用蒸馏水适当稀释 取 50 L 进行酶联免疫测定 6 2 4 2 3 海水试样制备 收集 2mL 待检海水样品至试管中 为了防止 DSP 在玻璃管内壁残留 立即添加 0 5mL 海水 预处理液 混匀 将该液体作为海水试样进行检测 6 2 4 3 ELISA 检测 a 用 DSP OVA 2 g mL 包被酶标板 每孔 100 L 4 过夜 b 弃去残液 用洗液洗 96 孔酶标板 3 次 每次 60s 后 用 1 PVA PBS 溶液封闭 每孔 300 L 37 恒温 3h 4 保存待用 c 酶标板用 PBS T 洗 3 次 每次 60s 后 加入不同浓度的 DSP 标准溶液 制作标准曲线 或 样品提取液与抗体溶液的混合液 1 1 每孔 100 L 置 37 1h d 酶标板洗 3 次 每次 3min 后 加入酶标二抗 每孔 100 L 37 40min e 同上述洗涤后 加入底物溶液 每孔 100 L 37 13min f 用 2mol L 硫酸溶液终止反应 每孔 50 L 450nm 波长处测定吸光度值 6 2 5 结果的计算和表述 6 2 5 1 计算百分比吸光度值 计算腹泻性贝类毒素标准液和样液的平均吸光度值 按式 5 分别求得每个 DSP 标准液和 样液的百分比吸光度值 5 100 0 S S A 式中 A 吸光度值的百分比 S 6 个适当的 DSP 标准液和样液的平均吸光度值 S0 0 g kg的 DSP 标准液的平均吸光度值 6 2 5 2 绘制校正曲线 以百分比吸光度值 算数级 为纵坐标 以 DSP 溶液浓度 g kg 对数级 为横坐标 绘 制出 DSP 标准液百分比吸光度值与腹泻性贝类毒素溶液浓度的校正曲线 每次试验均应重新绘制 校正曲线 6 2 5 3 结果的计算 在 6 2 5 2 绘制的校正曲线上读取样液百分比吸光度值所对应的 DSP 浓度即为试样中 DSP 的 含量 g kg 从校正曲线读出的浓度值应乘以相对应的稀释系数 6 2 5 4 结果的表述 当测定值小于 50 g kg 时 报告 DSP 的含量为小于 50 g kg HY T 18 当测定值大于等于 50 g kg 时 为 DSP 的实际测定值 6 2 6 测定低限 回收率 6 2 6 1 测定低限 本方法的测定低限为 50 g kg 6 2 6 2 回收率 本方法的回收率约为 90 6 2 7 健康和安全 任何 DSP 含量值大于 200 g kg 国际惯例表示方式为 20 g 100g 的样品即被认为是有害的 对人类食用不安全 标准液含有 DSP 应特别小心 避免接触 反应终止液为 2mol L 硫酸 避免接触皮肤 6 2 8 注意事项 所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡 再依次用自来水 蒸馏水冲洗 6 3 神经性贝毒的检验 ELISA 法 6 3 1 原理 本方法的测定原理是竞争性酶联免疫吸附试验反应 微孔板包被有针对神经性毒素 NSP 抗体的捕捉抗体 加入标准或样品溶液及神经性毒素 NSP 酶标记物 游离神经性毒素 NSP 与神经性毒素 NSP 酶标记物竞争神经性毒素 NSP 抗体 同时神经性毒素 NSP 抗体与捕捉抗体连接 没有结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去 将底物和发色剂加入 到孔中并且孵育 结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物 加入反应停止液后使颜色 改变 在 450nm 测量 吸光强度与样品中的浓度成反比 6 3 2 试剂和材料 除另有规所有化学试剂均为分析纯 水为蒸馏水或同等纯度的水 6 3 2 1 甲醇 6 3 2 2 浓缩液 6 3 2 3 抗体浓缩液 6 3 2 4 抗原 神经性贝毒与载体蛋白 卵清蛋白 OVA 的结合物 NSP OVA 6 3 2 5 兔抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物 酶标二抗 6 3 2 6 ELISA 缓冲液系统 包被缓冲液为 pH9 6 的碳