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研究计划范文 研究计划xx年1月-6月1）收集患慢性扁桃体炎IgA肾病患者及慢性扁桃体炎非肾炎患者的扁桃体和外周血；2）扁桃体淋巴细胞分离及Th17/Treg的免疫失衡状态的观察；3）扁桃体细菌分离及鉴定；4）外周血中的淋巴细胞，流式细胞计数法测定Th17细胞和Treg细胞数目和比率；xx年7月至xx年7月1）建立Hs感染BALB/c小鼠及Hs感染的IgA肾病BALB/c小鼠模型，用CCL20抗体对上述小鼠进行干预；2）观察Hs感染导致肾脏免疫炎症损伤过程中肾组织形态学变化及其与Th17细胞免疫效应之间的对应关系；xx年8月至xx年12月项目结题汇报。 一、临床标本的收集及处理 1、研究对象收集患慢性扁桃体炎IgA肾病患者及慢性扁桃体炎非肾炎患者的扁桃体和外周血，尿液； 2、扁桃体淋巴细胞分离采用免疫磁珠法分离手术切除扁桃体组织中的淋巴细胞，用流式细胞计数法测定其中Th17细胞和Treg细胞数目和比率，及J链mRNA阳性的IgA细胞数；观察上述两组患者扁桃体中Th17/Treg的免疫失衡状态； 3、扁桃体细菌分离及鉴定收集扁桃体隐窝分泌物接种在普通琼脂培养基及HE琼脂培养基，有氧孵育后根据典型菌落形态及生化特点鉴定细菌,分离溶血性链球（Hemolyticstreptocous，Hs）将其处理后进行后续实验。 4.收集患慢性扁桃体炎IgA肾病患者及慢性扁桃体炎非肾炎患者的外周血，免疫磁珠法分离外周血中的淋巴细胞，流式细胞计数法测定Th17细胞和Treg细胞数目和比率；5.观察各组患者的血尿、蛋白尿 二、动物实验 1、建立IgA肾病及链球菌感染IgA肾病BALB/c小鼠模型，采用CCL20抗体对其进行干预1）以BALB/c小鼠为研究对象，用脂多糖、四氯化碳、牛血清白蛋白联合建立IgA肾病小鼠模型；2）将溶血性链球菌经鼻接种小鼠，建立溶血性链球菌感染小鼠模型（参考文献Proc NatlAcad SciUSA.xxMar30;107 (13):5937-42.），在此基础上，用脂多糖、四氯化碳、牛血清白蛋白联合干预溶血性链球菌感染小鼠，建立链球菌感染IgA肾病小鼠模型；（IgA肾病小鼠模型+溶血性链球菌经鼻接种）4）实验分组正常对照小鼠组、IgA肾病小鼠组、Hs感染小鼠组、Hs感染IgA肾病小鼠组、 2、观察模型小鼠淋巴组织、肾组织中Th17/Treg免疫平衡的影响1）免疫磁珠法分离各组小鼠淋巴组织、外周血、肾组织中的淋巴细胞，流式细胞计数法测定Th17细胞和Treg细胞数目和比率；2）原位杂交检测各组小鼠淋巴组织及肾组织中J链mRNA阳性的IgA细胞数；3）ELISA检测肾组织匀浆液中CCL 20、IL17A，CCR6等的表达；4）观察各组小鼠血尿、蛋白尿变化。 国内外动态，理论依据目前认为免疫反应介导的炎症损伤是肾小球疾病的始发机制，CD4+T细胞是参与肾小球肾炎发生发展过程中的重要免疫细胞。 CD4+T细胞按照其分化和功能特性分为四大亚群Thl、Th 2、调节性T细胞（Tregs）和Th17 (1)。 作为辅助性T细胞的新亚群，Tregs和Th17因其参与了众多自身免疫性疾病的发生发展成为研究热点(2,3)。 Th17通过分泌IL-17等细胞因子来诱导免疫过度应答并发挥促炎作用；而Tregs则通过胞内转录因子Foxp3发挥促免疫耐受作用，从而保护机体免受炎症损伤(2,3)。 由于Th17和Tregs相互拮抗的作用，使它们成为评价免疫平衡的新标尺。 研究表明，Th17不仅参与了支气管哮喘、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症等多种自身免疫性疾病的发生发展，而且Thl7的免疫应答也涉及到了肾小球肾炎的病理损伤过程 (4)。 Th17介导肾脏损伤的病理生理学机制可能如下Thl7细胞自循环中浸润至肾实质，分泌大量IL- 17、TNF-、IL- 21、IL-22等细胞因子，这些细胞因子作用于肾小管上皮细胞、系膜细胞等肾脏固有细胞的表面受体，使其释放大量的趋化因子（CCL 20、CCL 2、CCL 3、CXCL 1、CXCL2等），趋化因子通过与相应的受体（CCR 6、CCR 1、CCR 2、CXCR 1、CXCR 1、CXCR2等）相结合，招募中性粒细胞、单个核细胞、Thl7细胞等最终触发免疫介导的肾脏病理损伤过程 (5)。 趋化因子是募集白细胞至病变部位导致病理损伤发生的关键介质。 趋化因子需要通过与受体结合才能发挥效应，多数趋化因子与受体之间并非一一对应关系，而是存在交叉现象；与其他趋化因子受体相比，CCR6具有相对的特异性，它只与趋化因子CCL20相结合(6,7)。 CCR6属于CC型趋化因子受体，未成熟的树突状细胞、B细胞、效应/记忆性T细胞和调节性T细胞均可表达CCR6，CCR6可调节炎症和免疫应答过程中的抗原提呈及免疫活性细胞的迁移(6-8)。 CCR6在支气管哮喘、类风湿性关节炎及移植物抗宿主病的免疫炎症发生机制中起到重要的促进作用 (9)。 CCL20在前炎症因子的刺激下其表达明显上调，CCL20与CCR6结合后可介导相应的免疫应答 (9)。 Welsh等10研究发现在人类肾小球肾炎肾组织中CCR6主要表达于血管周围和肾小球毛细血管内皮细胞。 Turner等 (11)在研究绵羊血清所致的小鼠肾小球肾炎发病机制中发现，同野生型肾炎小鼠相比，CCR6基因敲除小鼠肾脏组织中Thl7细胞和Tregs细胞浸润减少而Thl细胞的数目则无显著变化。 如果将Tregs细胞过继转移至CCR6基因敲除的肾炎小鼠，则其肾脏形态及功能损害则能够得到改善。 这些结果提示CCR6能够将Thl7细胞和Tregs细胞募集至肾脏组织，而Tregs细胞的减少也许是绵羊血清所致的肾炎小鼠病变加剧的重要原因之一。 上述研究提示CCR6对疾病进程的影响可能取决于Th17和Tregs两者在疾病发生过程中何种免疫应答占优势。 Kallal等 (9)研究发现，CCL20/CCR6通路活化可通过调控树突状细胞的募集功能促进呼吸道合胞病毒（RSV）所致肺损伤的形成。 如果用CCL20抗体对小鼠进行干预或者将小鼠CCR6基因敲除，则能够减轻RSV所致的肺损伤。 由此可见，呼吸道感染过程中CCL20/CCR6通路对Th17/Tregs平衡的影响可能有别于绵羊血清所致的肾小球肾炎发生机制；进一步而言，呼吸道感染所诱发的免疫反应介导肾小球炎症损伤过程中CCL20/CCR6通路对Th17/Tregs平衡的影响机制亦不得而知。 急性肾小球肾炎、IgA肾病等一些肾脏疾病常常在上呼吸道感染后发病，溶血性链球菌（简称链球菌）所致的扁桃体炎是其最常见的前驱表现。 IgA肾病患者扁桃体感染后常常出现肉眼血尿或尿检异常加重。 Huang等 (12)以腭扁桃体隐窝内甲型链球菌灭活菌株刺激IgA肾病病人组和非肾炎病人组(对照组)扁桃体淋巴细胞，结果发现与对照组相比，IgA肾病组淋巴细胞分泌的CD4+CD25+调节性T细胞（Tregs）的数量明显减少。 Wang等 (13)采用鼻内接种A组溶血性链球菌方法建立上呼吸道感染小鼠模型，结果发现小鼠脾脏、颈部淋巴结及鼻周淋巴组织中能够诱导Th17细胞分化的TGF- 1、IL-6表达明显增高，同时CD4+IL-17+细胞的表达也显著增高。 这些研究提示链球菌感染扁桃体后其淋巴细胞分泌的Th17/Treg发生免疫失衡，即Treg亚群表达下调而Th17亚群表达上调。 综上所述，推测上呼吸道链球菌感染相关性肾脏损害的发生可能存在以下机制链球菌感染诱导Th17细胞分化，Th17细胞经循环浸润至肾脏组织，释放大量趋化因子并激活CCL20/CCR6通路最终导致肾脏免疫损伤出现。 基于此，本项目拟从链球菌感染致Th17/Treg免疫失衡入手，收集患慢性扁桃体炎的IgA肾病及非肾炎