蔬菜中有机磷农药残留的快速检测.doc

精品文档蔬菜中有机磷农药残留的快速检测（黄宽，2015级食品质量与安全专业）【内容摘要】有机磷农药作为一类高效、广谱的杀虫剂被广泛地用于农业、家庭以及仓储等的杀虫，能有效地控制害虫、杂草及细菌的生长，提高农业产量。但农药中有些物质在一定环境条件下能长时间保持其毒活性，若长时间摄取残留农药则会影响人类的健康。残留农药在人体内不断累积，能引起各种严重疾病。因此，研制出简便、快速及准确地检测有机磷农药残留对于保护环境安全与人体健康具有非常重要的意义。【关 键 词】有机磷农药 ，酶抑制法 ，快速检测一、有机磷农药1.1有机磷农药的特点有机磷杀虫剂是我国使佣最广泛、佣量最大的一类杀虫剂，其品种繁多，性能也千差万别，但综合来起来看有如下特点：(1)杀虫谱较宽。目前常佣有的机磷杀虫剂品种可以防治多种农林害虫，有些可佣与防治与卫生害虫及家畜、禽体外寄生虫。(2)杀虫方式多样化，可满意多方面需要。大多数品种具有触杀和胃毒作佣，有些品种具有内只作佣或渗透作佣，个别品种具有熏蒸作佣，可进行多种方式施药，防治地上、地下、钻蛀、刺吸式等不同类型的农林害虫。（3）在自然环境和动植物体内易降解.正确使用时残留问题小,不致污染环境且在高等动物体内无累积毒性。1.2有机磷农药的毒性有机磷农药可经消化道、呼吸道及完整的皮肤和粘膜进入人体。职业性农药中毒主要由皮肤污染引起。吸收的有机磷农药在体内分布于各器官，其中以肝脏含量最大，脑内含量则取决于农药穿透血脑屏障的能力。有机磷农药中毒的主要机理是抑制胆碱酯酶的活性。有机磷与胆碱酯酶结合，形成磷酰化胆碱酯酶，使胆碱酯酶失去催化乙酰胆碱水解作用，导致组织中能使神经过度兴奋的乙酰胆碱过量蓄积 。这种乙酰胆碱传导介质代谢紊乱,可导致迟发性神经毒性,引起昏迷等性状。二、酶抑制法2.1酶抑制法的原理酶抑制法测定有机磷农药残留是根据有机磷农药的毒性对酶分解底物的抑制作用进行的， 其酶源有来自动物的胆碱酯酶和从植物中提取的植物酯酶。动物胆碱酯酶法是基于有机磷农药的毒性抑制乙酰胆碱酯酶催化底物水解生成乙酸和胆碱, 后者与 5 ,5-二硫代-双-2-硝基苯甲酸反应, 生成黄色产物 5-硫代-2-硝基苯甲酸, 其在 410 nm 处有最大吸收 ,测定其在单位时间内的生成量，即可测得乙酰胆碱酯酶的活性。 植物酯酶可以催化乙酸萘酯水解为萘酚和乙酸，萘酚与显色剂固蓝 B 作用形成紫红色的偶氮化合物,从而发生显色反应。2.2动物胆碱酯酶法自从 1951 年发现有机磷农药在体外也能抑制胆碱酯酶以来,绝大多数研究都是基于动物胆碱酯酶这一原理进行的 。目前，胆碱酯酶法检测有机磷的方法主要有酶片法、酶抑制分光光度法以及胆碱酯酶生物传感器法。（1）酶片法酶片法是将敏感生物的胆碱酯酶和生色基质液经固化处理后加载到滤纸片或类似载体物质上，基质在胆碱酯酶的催化作用下迅速分解，生成胆碱(蓝色)和乙酸.有机磷和氨基甲酸酯农药对胆碱酯酶有抑制作用,使催化、水解、变色的过程发生改变。若胆碱酯酶受到抑制, 基质就不能水解、不变色 ,表明样品中含有机磷和氨基甲酸酯类农药(呈阳性)。目前广泛使用的速测箱、速测卡法均属于酶片法。近年来国内常见的用固化含有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的试纸片建立的适合我国蔬菜中部分农药残留限量的现场监督检测的速测卡法 , 其检出限一般在 0 .3 3 .5 m g/kg , 检出时间为 15 min 操作简单,速度快 ,测试成本低廉。也有学者利用马血清中的乙酰胆碱酯酶与底物氯化乙酰胆碱作用, 根据反应前后的 pH 值变化及指示剂的颜色变化情况 ,建立的一种可以作定性及半定量分析的酶片快速检测法 , 应用于实际检测黄瓜中农残的效果较好。（2）酶抑制分光光度法有机磷类农药对乙酰胆碱酯酶活性有抑制作用,浓度越高,抑制率越高。通过分光光度计测定吸光度随时间的变化值,并与空白对照比较求得酶抑制率,从而判定样品中是否有有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。该法所需仪器设备简单、灵敏度高、前处理简单、检测时间短 , 可及时检测含农残的蔬菜。 曾有报道以鸡脑为酶源提取乙酰胆碱酯酶，利用酶抑制分光光度法检测油白菜中有机磷农药(对硫磷、辛硫磷、氧化乐果)的残留量，可使 3 种农药的回收率分别达到 97 %,、101 %和 99 %.Ingrid Walt 等从镰刀菌 pisi 中提取角质酶 ，利用酶抑制分光光度法和 96 孔板法同时检测多个样品中有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的含量，该法对毒死蜱和对氧磷的检测限分别为 2 .6 mg/L 和 0 .04 mg/L。2.3.3胆碱酯酶生物传感器 胆碱酯酶生物传感器法是目前农药残留速测技术中的研究热点 ,其在研究方法多样化、灵敏度、准确性、响应时间等方面都具有很大优势。 (1)电化学型：电化学型生物传感器是基于胆碱酯酶催化底物水解生成电活性物质的反应而构建。通常采用电化学氧化法直接测定生成的巯基胆碱或者先用胆碱氧化酶氧化生成的胆碱，进一步用电化学方法测量在此催化氧化过程中消耗的 O2 或生成的 H2 O2 .Andreescu 等以果蝇中提取的胆碱酯酶为酶源，以苯乙酸酯为底物, Ag/Al 参考电极 , 研制了一种丝网印刷电化学传感器 ,其对对氧磷和毒死蜱的检测限分别为 5 .2 10-3 mg/L 和 0 .56 10-3 mg/L。 (2)光化学型：构建光化学型生物传感器的基础是胆碱酯酶催化底物水解生成光活性物质的反应.在酶水解底物乙酰胆碱过程中,生成的乙酸引起溶液 pH 降低, 可引起 pH 指示剂溴甲酚紫的颜色变化。根据这一原理 ,已构建了一种具有三层生物活性膜的“三明治”型生物传感器。胆碱酯酶被固定在外层的经亲水修饰的聚偏氟乙烯膜上,中间层为同溴甲酚紫混在一起的溶胶凝胶层, 下层为玻璃。同样,也有根据溶液 pH 降低引起 pH 指示剂氯酚红颜色变化的原理 ,将 AChE 及氯酚红分别共价固定在可控多孔玻璃球上,建立了一种流动式注射分析方法Pardo-Yissar 等则设计了一种 AChE 与经化学修饰的 CdS 纳米离子相结合的光电流传感系统。在 AChE 抑制剂存在情况下 ,AChE 的催化活性受到抑制，水解产物巯基胆碱的量降低,引起光电流减小，这种酶与 CdS 纳米离子联合的光电流传感系统有可能发展为一类通用的生物传感模式。 (3)压电型：设计压电型生物传感器的基本思路就是将胆碱酯酶(ChE)或其抑制剂固定于石英晶体表面 ,当待测的 ChE 及其抑制剂与所固定的识别物相互作用而产生特异结合时, 将导致晶体表面质量负载的改变 , 通过传感器的频率变化加以检测。Abad 等采用直接吸附和共价结合两种方式将 AChE 固定在石英晶体表面制成压电生物传感器.利用有机磷抑制固定化的 AChE 与吲哚乙酸生成不溶性靛蓝染料的反应 , 测定压电晶体的振荡频率的变化。M akow er 等建立了一种竞争亲合分析法 ,对氧磷作为识别元件通过螯合作用被固定在压电传感器金电极的表面 .经过对氧磷修饰后的表面可以同 BChE 结合 ,当样品中存在杀虫剂时 ,电极表面结合的 BChE 量就会减少。ChE 可以与可卡因类化合物相结合, 酶催化速率水解常数非常小.基于此 ,Knosche 等将可卡因的衍生物苯甲酰爱冈宁(benzoylecgonine)固定在压电晶体表面, 并研究了其与 AChE 结合的动力学特性 ,结果表明 ,苯甲酰爱冈宁可作为亲和配基用于生物传感分析。Nunes 等制成了胆碱酯酶(ChE)的电流型生物传感器 ,可用于谷物等样品中氨基甲酸酯类杀虫剂涕灭威、西维因、灭多虫和残杀威的测定, 测定线性范围为 5 10-5 g/g ,检测限为 1 10-4 3 .5 g/g。 H olger Schulze 等将AchE-传感器直接应用于以N-溴代丁二酰亚胺为氧化剂 ,以异辛烷为萃取剂萃取的植物样本 ,此法检测时间为 2 h , 重复率为 84 %, 对氧磷的检测限可达 2 g/kg , 达到欧盟食品农药残留的安全限值。2.3植物酯酶抑制法植物酯酶法快速检测农药残留的方法中, 多采用敏感家蝇头部获得的乙酰胆碱酯酶, 但是动物酯酶常表现为保持期短,需冷冻低温保存 .而植物酯酶酶源丰富 ,提取和保存较为方便,只需以一定比例的水或缓冲液混合离心获得的上清液即可作为粗酶液 ,并在-4 保存即可.而且与动物酯酶相比, 植物酯酶抑制法的测量准确度和精密度均不逊色, 能达到快速检测农药残留的目的 . 1987 年 ,中国农业部环保所研制出一种酶片和显色基质片,不需仪器,即可在田间或菜市场快速测定蔬菜和水果中的有机磷类农药,其检测限为 0 .5 10 mg/k。而后有人利用自制的植物酶片和高灵敏度化学检测液(速测灵)，使检测出有机磷农药残留的灵敏度达到 0 .4 10 mg/L 和 0 .18 10 m g/ kg ,检测时间为 5 10 min , 检测成本为 0 .2 0 .3 元人民币。至此 ,植物酯酶法检测有机磷农药残留开始受到了研究学者的广泛关注 ,各方面的研究也随即展开。三、结束语随着人们对蔬菜中农药残留及食品安全性问题的关注 ,只有不断地更新和完善农药残留的快速检测技术 ,才能满足人类对健康和食品贸易的要求。而酶抑制法检测有机磷农药残留相对于传统的波谱法 ,色谱法在简便、快速和检测成本等方面都有较大的优越性。基于动物胆碱酯酶的酶片法、分光光度法以及生物传感器法 ,准确性和灵敏度尚好 ,其中近年来的研究热点生物传感器法 , 我国还停留在研发阶段 ,应着力解决其稳定性、精确性等问题尽快将研究成果投入实际运用 。而相对于动物酶法,植物酯酶法在提取、保存、检测成本