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文档简介

。实验二十五 测定叶绿素a和b的方法及其计算一 目的要求:熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。二 实验原理:如果混合液中的两个组分,它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异,但吸收曲线彼此有些重叠,在这种情况下要分别测定两个组分,可根据Lambert-Beer定律,通过代数方法,计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响,最后分别得到两种组分的含量。如图z-4叶绿素a和b的吸收光谱曲线,叶绿素a的最大吸收峰在663nm,叶绿素b在645nm,吸收曲线彼此又有重叠。图z-4 叶绿素a和b的吸收光谱曲线横坐标为波长(nm),纵坐标为比吸收系数根据Lambert-Beer定律,最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液,它们的浓度C与光密度OD之间有如下的关系: OD1=Caka1+Cbkb1 (1) OD2=Caka2+Cbkb2 (2) 式中:Ca为组分a的浓度,g/L。Cb为组分b的浓度,g/L。OD1为在波长1(即组分a的最大吸收峰波长)时,混合液的光密度OD值。OD2为在波长2(即组分b的最大吸收峰波长)时,混合液的光密度OD值。ka1为组分a的比吸收系数,即组分a当浓度为1g/L时,于波长1时的光密度OD值。kb2为组分b的比吸收系数,即组分b当浓度为1g/L时,于波长2时的光密度OD值。ka2为组分a(浓度为1g/L),于波长2时的光密度OD值。kb1为组分b(浓度为1g/L),于波长1时的光密度OD值。 从文献中可以查到叶绿素a和b的80%丙酮溶液,当浓度为1g/L时,比吸收系数k值如下:波 长(nm)叶绿素a叶绿素b66382.049.2764516.7545.60将表中数值代入上式(1)、(2),则得:OD663=82.04Ca+9.27CbOD645=16.75Ca+45.60Cb经过整理之后,即得到下式:Ca=0.0127 OD663-0.00269 OD645Cb=0.0229 OD645-0.00468 OD663如果把Ca,Cb的浓度单位从原来的g/L改为mg/L,则上式可改写为下列形式:Ca=12.7 OD663-2.69 OD645 (3) Cb=22.9 OD645-4.68 OD663 (4) CT= Ca+ Cb=8.02 OD663+20.21 OD645 (5)(5)式中CT为总叶绿素浓度,单位为mg/L。利用上面(3)、(4)、(5)式,即可计算出叶绿素a和b及总叶绿素的浓度(mg/L)。附注一般大学教学实验室所用的分光度计多为721型,属低级类型,其单色光的半波宽要比中级类型的751型宽得多,而叶绿素a和b吸收峰的波长相差仅18nm(663-645nm),难以达到精确测定。此外有时还由于仪器本身的标称波长与实际波长不符,测定的正确性就更差,不适用于测定。751型有时也由于波长不够准确,会带来一定误差。可用叶绿素对波长进行校正。为校正仪器波长所需的叶绿素a和b的需要量很少,用纸层析法很快就能分离制得。取植物叶子约1g,用乙醚提取叶绿体色素,再用毛细管将色素溶液画在3mm厚滤纸上使成一直线,为使分离效果好,一般重复点样一次即可。然后于密闭容器中进行上行层析,溶剂为含有0.5%丙酮的石油醚。层析结束,用剪刀小心地剪下蓝绿色的叶绿素a和黄绿色的叶绿素b,注意剪时尽量避开分层不清晰的色区。最后分别浸于80%丙酮中,洗下叶绿素a和b。三 实验器材与试剂:1实验仪器 高级型分光光度计、离心机、台天平、剪刀、研钵、漏斗、移液管。2实验试剂 丙酮、碳酸钙。3实验材料 植物叶片。四 操作步骤:1、色素的提取:取新鲜叶片,剪去粗大的叶脉并剪成碎块,称取0.5g放入研钵中加纯丙酮5ml,少许碳酸钙和石英砂,研磨成匀浆,将匀浆转入量筒中,并用适量80%丙酮洗涤研钵,用80%丙酮定容至10ml,吸取2.5ml加入有10ml80%丙酮的量筒中,过滤,滤液备用。2、测定光密度:取上述色素提取液4ml,转入比色杯中,以80%丙酮为对照,分别测定663nm、645nm处的光密度值。3、按公式(3)、(4)、(5)分别计算色素提取液中叶绿素a、叶绿素b、及叶绿素a+b的浓度。再根据稀释倍数分别计算每g鲜重叶片中色素的含量。【注意事项】1.由于植物叶子中含有水分,故先用纯丙酮进行提取,以使色素提取液中丙酮的最终浓度近似80%。2.由于叶绿素a、b的吸收峰很陡,仪器波长稍有偏差,就会使结果产生很大的误差,因此最好能用波长较正确的高级型分光光度计。五 作业:1、试比较阴生植物和阳生植物的叶绿素ab的比值有无不同。2、分光光度法和比色法有何异同?叶绿素a和b

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