蛋白酶产生菌的筛选.doc

_蛋白酶产生菌的筛选组别：第*组班级：生工*班组员：* 指导老师：*一、实验目的学习从自然界中分离蛋白酶产生菌二、实验内容蛋白酶产生菌的分离三、实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。四、实验材料和用具1.材料：土壤样品2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。五、操作步骤（一） 配制所需培养基按照以下配方配制所需的培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 1.52.0g，水 100ml，pH 7.2 配制200mL奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.07.2脱脂奶粉 3g，配制200mL（二） 分离1.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。2.取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入7580水浴中热处理10min以杀死非芽孢细菌。3.取加热处理过的土壤悬液100200L，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于3032下培养2448h.4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。（三） 筛选1、从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种奶粉斜面培养基，再转接奶粉培养基平板上，3032下培养2448h。2、选择水解圈直径与菌落直径比值大的菌，接入牛肉膏蛋白胨培养基30-32振荡培养48小时，将发酵液过滤或离心，取清夜检测蛋白酶活力进行复筛。六、实验结果：相关图片：（2）菌株的分离根据菌落大小、形状、表面光泽、隆起程度、透明程度、边缘性状和菌落颜色的差别，最终从培养基上筛选出23个菌落。（3）将分离到的菌株分别接种到含脱脂奶粉的培养基上，置于32培养60h，于室温下观察是否产生细胞外蛋白酶，分解培养基中的脱脂牛奶，进而产生肉眼可见的水解透明圈。结果表明，在接种的23株菌落中，共有18株产生胞外蛋白酶分解脱脂牛奶，形成肉眼可见的透明圈。从中筛选出9株水解圈与菌落直径比值较大的菌株。如下表：菌株编号123456789比值+说明：“+”表示：水解圈与菌落直径比值约为3：1，“+”表示：水解圈与菌落直径大于3：1.。六、结果分析在奶粉培养基平板上，蛋白质被孢芽杆菌产生的蛋白酶水解，形成透明圈（见实验相关图片）。不同种类的微生物产生的蛋白酶的种类和活力各不相同，起对奶粉中蛋白质的水解能力各不相同，所形成的水解圈与菌落大小比值故而不同，