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精品文档CRISPRCas基因组改造技术研究进展郭嘉海1 王奇奇 2邹虎山3（1.生物技术1班 学号：121303109，2.生物技术1班 学号：121303110，3.生物技术1班 学号：121303111）摘要：CRISPRsCas系统是一种细菌获得性免疫系统，为一段规律成簇间隔短回文重复，保护细菌和古生菌免遭病毒、质粒等的入侵。这种免疫系统是由一种小RNA和多结构域蛋白质蛋白复合物构成，其作用机理可能与真核生物的RNA干扰过程类似。这个系统已发展为一种高效、特异、操作简单易行的基因修饰工具，与TALEN、ZFN相比CRISPRCas系统的出现使得基因编辑变得更加有效和简易，具有更大的潜力。CRISPRCas系统已成功应用到细胞、干细胞、小鼠、斑马鱼及植物等多种生物，显示了其强大的基因编辑优点1。综述了CRISPRCas系统的技术原理及其在生物学研究中的应用最新研究进展，并探讨了该技术的发展前景。关键词：规律成簇间隔短回文重复(CRISPRs)；内切酶；同源重组机制；非同源末端连接机制；脱靶效应 ；Abstract：CRISPRsCas is the elucidation of the prokaryotic adaptive immune system and clustered regularly inter- spaced short palindromic repeats，which protects bacteria and archaea against viruses or conjugative plasmidsThe immuni tv svstem consists of bacteria RNA molecules and versatile multidomain proteins or protein complexes，which may be simi lar to the mechanism of RNA interfereneeCRISPRCas interfefence machines are utilized to develop into a genome edit ing tools with efficiency，specialization and simplicityDistinct from TALEN and ZFN，the CRISPR-Cas system has recent ly emerged as a potentially facile and efficient alternative t001Currentlyresearches have already modified the genome of cell，IPS，mouse，zebra，fish and plant with this system that show powerful ability to edit geneThe technical principles of CRISPRCas system and the latest progress on the application in biological study of CRISPRCas system was reviewed，and the development future of the system was discussed Key words：clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPRs)；endonuclease；homologous recombi nation；nonhomologous end joining；off-target effect.CRISPRs(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)为规律成簇间隔短回文重复，是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构2-3。CRISPR通过与一系列相关蛋白、前导序列一起，为原核生物提供对抗噬菌体等外源基因的获得性免疫能力。这种结构的作用机理可能与真核生物的RNA干扰过程类似，最早于1987年在大肠杆菌(Escherichiacoli)K12的i印基因侧翼序列中被发现4。1 CSPRCas技术原理CRISPR是一个特殊的DNA重复序列家族，广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列组成，重复序列的长度通常为21.48bp，重复序列之间被2672bp间隔序列隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列与靶基因进行识别睁1。Cas(CRISPR associated)：存在于CRISPR位点附近，是 一种双链DNA核酸酶，能在向导RNA(guidance RNA) 引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。CRISPR Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫，而这种特异性是由间隔序列决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了CRISPR介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR间隔序列的动态性变化(即通过增加或删除间隔序列)来实现的4。 与TALEN、ZFN不同，CRISPRCas系统的出现使得基因编辑变得更加有效，具有更大的潜力。在细菌中，CRISPR参与协助一些细菌躲避哺乳动物免疫系统。目前已经发现3种类型的CRISPRCas系统，这3种类型可根据Cas位点基因组织源性的不同来区分。这3种类型进一步又可分成10种亚型，并表达针对干 扰的不同蛋白复合物。虽然有很多CRISPRCas系统需要多种蛋白的参与，但是在很多细菌的胞内都只需要Cas9内切酶就足够，这种CRISPRCas系统被称作2型系统(Type II systems)， 2型系统以Cas9蛋白以及向导RNA为核心，即 CRISPRCas RNA引导核酸酶(CRISPRCas RNAguided nuclease，CRISPRCas RGN)，Cas9内切酶是一 种DNA内切酶，很多细菌都可以表达该蛋白，Cas9内切酶能够为细菌提供一种防御机制，避免病毒或质粒等外源DNA的侵入。在二型CRISPRCas系统中，短链外源DNA整合在CRISPR基因组中，转录加工成CRISPR RNA(crRNA)，这些crRNA参与反式调控激活crRNA(tracrRNAs)指导Cas蛋白特异性位点剪切致病 DNAtnl。然而，最近有研究发现，这两种RNA可以被“改装”成一个向导RNA(singleguide RNA，sgRNA)6。这个sgRNA足以帮助Cas9内切酶对DNA进行定点切割。研究表明，Cas9蛋白对靶序列的识别需要的是crRNA中 一段种子序列及与靶DNA序列互补的序列(PAM序列)。Cas9内切酶在向导RNA分子的引导下对特定位 点的DNA进行切割，形成双链DNA缺口，然后细胞会借助同源重组机制(homologous recombination)或者非同源末端连接机制(nonhomologous end ioining)对断裂的 DNA进行修复。如果细胞通过同源重组机制进行修复， 会用另外一段DNA片段填补断裂的DNA缺口，因而会引入一段新的遗传信息。并且可通过设计不同crRNA， 使得CRISPRCas系统能剪切不同的DNA序列7-9。CRISPRCas系统可以通过共转染表达Cas9蛋白及 crRNA的质粒带人到任意人类细胞中。另外，这种RNA引导的DNA内切酶具有复杂的基因干扰能力。还可以定向整合到IPS细胞中。Cas9内切酶还可以转换成其他 内切酶，能对DNA修复机制进行更多的调控。但是还需 要更多的研究来证明这种系统的工作能力及潜在的脱靶影响尤其是在复杂的基因组中，CRISPRCas系统是否具有识别特异性单一位点的能力。CRISPR 系统如何避免自身免疫的发生在研究 CRISPR/Cas 系统的过程中有一个很重要的问题宿主菌利用 crRNA 与靶序列配对结合介导外源 DNA 切割，而 crRNA 本身是由宿主菌的基因组为模板转录出的 pre-crRNA 经加工后形成的，这就是说相同的靶序列也存在于宿主的基因组中，那么 CRISPR/Cas 系统应该有一套机制将自身序列和外源的靶序列区分开最近表皮葡萄球菌里的一项研究发现了 CRISPR 系统区分靶点和自身基因组的方法在表皮葡萄球菌里面成熟的 crRNA 除了 spacer 以外在其 5 端和 3 端包含有部分 repeat 序列10。当外源 DNA 入侵宿主菌时，crRNA 扫描到外源 DNA 上的靶序列(protopacer)并与之配对结合，但靶位点两端的序列不能发生配对，对于宿主菌基因组中相同序列的“protospacer”来说， crRNA 除了能与“protospacer”配对外，两端的 repeat 序列也能与“ protospacer”两侧的基因组 DNA 完全配对，实际上只有不完全的配对才允许核糖核蛋白复合体发挥切割活性，通过这样的机制 CRISPR/Cas 系统避免自我免疫54另外，在研究稻白叶枯黄杆菌中的 CRRISP/Cas 系统时发现，虽然在宿主菌的 CRISPR 中的 spacer 序列能够与噬菌体 Xop411 一段靶序列完全配对，但宿主菌对噬菌体 Xop411 依旧不抵抗，分析发现是噬菌体 protospacer 临近的 PAM (proto-spacer adjacent motifs)突变引起，这说明外源 DNA 的 protospacer 序列临近的 PAM 对 CRISPR/Cas 系统识别外源 DNA 的必要性53宿主菌的 CRISPR 基因座位的间隔序列(spacer)临近位置不存在 PAM，这也是 CRISPR 系统能够区分自身 DNA 和外源 DNA 避免发生自身免疫的原因之一2 CRISPRCas技术应用21在细胞水平上的应用 从实际应用的角度来看，CRISPRCas系统比TALENs更容易操作因为每一对TALENs都需要重新合成。而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷 酸就行。其中2型CRISPRCas系统(RNA介导的 Cas9系统)由于其简便性而应用得更多。Cho等。研究发现。对化脓性链球菌编码的Cas9内切酶进行改造之后也可以让它们在人类细胞的细胞核中被活化，然后再搭配针对人体DNA序列设计的长约20 bp的双RNA复合体或者sgRNA就可以对人体基因组进行定 点切割和改造。这套Cas9系统能在多种人体细胞包括诱导多能干细胞预定的DNA位点进行基因组双链DNA切割，并存在后续的修复现象，成功率高达38， 并且Cas9内切酶对细胞几乎没有毒性并能以非常高的效率对普通的基因组位点进行定向基因替换的操作。Jinek等发现这套RNA介导的Cas9系统还能够在人体细胞内诱发位点特异性的基因组修饰行为，而 且Cas9蛋白与向导RNA结合、组装的行为是这套位点特异性的基因组修饰过程中的限速步骤。麻省理工学院张峰的研究团队利用一个包含两个靶向不同基因的spacers的crRNA实现了同时对哺乳动物基因组上 两个基因进行编辑等利用TALENs和CRISPRs 对细胞基因组同一基因进行修饰，效率分别为034和5179，并且后者还较容易生成纯合子突变克隆(总克隆的725)11。 22在生物体水平上的应用 CRISPRCas系统除了能应用在细胞学研究上外，研究者发现Cas9系统还可以对生物体进行基因组改造的操作。2013年1月，洛克菲勒大学的研究者利用 CRISPRCas系统将设计好的DNA模板替换相应基因来达到基因的定向修饰120。他们用这种方法对肺炎链球 菌和大肠杆菌进行基因突变，发现100的肺炎链球菌和65的大肠杆菌带有突变，证实了这种方法可以用于细菌的基因组修饰。借助这一技术可以对各种微生 物进行遗传学改造打造出符合人类需要的工程微生物使其造福人类，在生物能源或生物制药等诸多领域具有极大的应用潜力。同时马萨诸塞州综合医院的研究者利用人工合成的sgRNAs指导Cas9内源性核酸酶 对斑马鱼胚胎基因进行修饰，并证明取得与ZFN一样的修饰效果。他们将编码Cas9蛋白的mRNA和特定的 向导RNA(与斑马鱼基因组DNA的匹配机率高达2459)注射到斑马鱼胚胎内，结果取得了成功，在所有被注射的斑马鱼胚胎内，10个切割位点中有8个位点 都发生了切割，并且引入了插入或者缺失突变n。 我国学者利用该技术也取得了突出成果，中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞的研究团队利用 CRISPRCas系统定点突变了水稻和小麦两个作物的 0s肋S和姗D等5个基因。原生质体中基因突变效 率为14538，水稻转基因植物中突变效率为494，并且在T0代获得了水稻纯合pds突变体，呈现预 期的白化和矮小表型。同时，通过同源重组DNA修复 途径，利用单链寡核苷酸DNA(ssDNA)作为模板，在基 因特定位点精确插入12 bp两个限制性内切酶识别序 列。该研究首次证实CRISPRCas系统能够用于植物的基因组编辑11。23人工构建 CRISPR/Cas9 的方法以及突变效率的检测ZFN 和 TALEN 对靶点的识别主要依赖于 DNA 结合蛋白对核酸的识别ZFN 中一个锌指蛋白(结构单元)识别三个碱基序列，而 TALEN 的一个 RVD 识别一个碱基，为了保证特异性，通常靶点长度在 10bp 以上。因此，在构建 ZFN 或是 TALEN 时需要根据靶点的序列来将锌指蛋白单元或是 RVD 排列组合起来，操作繁琐、制备周期长、需要耗费大量的劳动和费用12。CRISPR/Cas9 系统是一个由核酸和蛋白质组成的核糖核蛋白复合物，它对靶点的识别依赖于核酸对核酸的识别，通过碱基的互补配对完成。打靶一个位点只需要在原有载体的基础上替换 2030 bp 的核苷酸，相当于合成一对引物，构建过程相对于 ZFN 和 TALEN 更加简单、快捷，适合规模化、高通量的组装12。ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9 打靶基因后引入突变的方式基本一致，都是 NHEJ 或是 HR在 CRISPR/Cas9 的应用中，活性检测或是突变效率的检测可以参照 ZFN 和 TALEN 方法。主要包括：靶位点直接 PCR 后 TA 克隆测序、限制性内切酶法和基于可以识别错配双链的错配内切酶检测法。3.结语与展望从 CRISPR 发现至今 25 年已经过去了， CRISPR 的功能逐步被解密。CRISPR 作为细菌和古细菌的一种免疫系统与哺乳动物后天免疫系统有类似之处，不同的是 CRISPR 的免疫记忆能够遗传给后代。获得免疫能力的细菌或是古细菌能够生存下来并能将免疫能力传递给下一代，非常完美地验证了拉马克的获得性遗传理论。除了免疫能力以外，最新的研究发现致病菌的 CRISPR 还可以通过调节内源基因表达帮助它躲避宿主的免疫系统同时增强其毒力。越来越多的研究表明 CRISPR 还可能有更多其他的功能，它作为一种保护装置能够帮助细菌和古细菌更好地适应外界不断变化的环境压力12。CRISPR/Cas9 作为最简单的 Type CRISPR 系统被成功地改造成为类似于 ZFN 和 TALEN 的 ENN。相对于 ZFN 和 TALEN 它的优势主要体现在其构建更加方便简单不同的物种、不同的细胞或是不同的靶点对于同一种 ENN 效率都有很大差异，很难轻易下结论哪种 ENN 对基因组的编辑效率会更高CRISPR/Cas9 独特之处是既可以作为双链的内切酶也可被改造成为切口酶，另外靶点的唯一限制是 3 端必须有 PAM 序列(NGG)，所以它的靶点在基因中出现的频率远高于 TALEN 和 ZFN CRISPR/Cas9 的主要缺点可能是它的脱靶效应，它对靶点的识别取决 14 bp 序列(PAM 和它 3 端的 11 bp)，这种长度的序列在基因组中很容易重复出现2。CRISPR/Cas9 作为第三代人工核酸酶成为目前研究的热点，相对于 ZFN 和 TALEN 有其独特的优势：a构建简单方便快捷，适用于任何分子生物实验室；b用于基因组的点突变编辑优于 ZFN 或 TALEN；cCRISPR/Cas9 精确的切口酶活性用于基因治疗安全性高于 ZFN 或 TZLEN可以预见，CRISPR/Cas9 在基础理论研究、临床治疗和农牧渔业等领域必将有越来越有广阔的应用前景，并且产生深远的影响2。参考文献：1肖安，胡莹莹，王唯晔，等 人工锌指核酸酶介导的基因组定点修饰技术J 遗传，2011，33( 7) : 665 6832方锐，畅飞，孙照林,李宁，孟庆永CRISPRCas介导的基因定点编辑技术J生物化学与生物物理研究进展，2013，40（8）:691-72031 Bolotin A，Quinquis B，Sorokin A，et a1Clustered regular ly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs)have spacers of extrachromosomal originJMicrobiology，2005，15l(Pt 8)：255125614 Barrangou R，Fremaux C，Deveau H，et a1CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotesJScience，2007，315(5819)：1709-1712 5Brouns S J，Jore M M，Lundgren M，et a1Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotesJScience，2008，321(5891)：960964 6Feng Z Y，Zhang B TEfficient genome editing in plants using a CRISPRCas systemJCell Res，2013(23)：1229-12327Hwang W