血清总蛋白和白蛋白测定实验方案.doc

_血清中总蛋白和白蛋白测定的实验方案血清总蛋白的测定：实验原理血清(浆)中蛋白质的肽键(-CO-NH-)在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。此反应和2个尿素分子缩合后生成的双缩脲(H2N-OC-NH- CO-NH2)在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。实验器材 分光光度计实验试剂1.6mol/L NaOH溶液称取NaOH 240g，溶于新鲜制备的蒸馏水约800ml中，定容至1L，贮于有盖塑料瓶中。2.双缩脲试剂 称取硫酸铜结晶(CuSO45H2O)3g溶于新鲜制备的蒸馏水500ml中，加入酒石酸钾钠(NaKC4H4064H2O），用以结合Cu2+，防止CuO在碱性条件下沉淀)9g和KI(防止碱性酒石酸铜自动还原并防止Cu2O的离析)5g。待完全溶解后，在搅拌下加入6mol/L NaOH溶液100ml，并用蒸馏水定容至1L，置塑料瓶中盖紧保存。此试剂室温下可稳定半年，若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。3.6070g/L蛋白质标准液可用定值参考血清或标准白蛋白作标准。实验操作取试管3支，混匀，置2530min或37 10min，在波长540mm处比色，用空白管调零，测各管吸光度。参考范围6080g/L。注意事项1.黄疸血清，严重溶血，葡萄糖，酚酞及溴磺酞钠对本法有明显干扰，故用标本空白管来消除。但如标本空白管吸光度太高，可影响测定的准确度。2.高脂血症混浊血清会干扰比色，可采用下述方法消除：取2支带塞试管或离心管，各加待测血清0.1ml，再加蒸馏水0.5ml和丙酮10ml，塞紧并颠倒混匀10次后离心，倾去上清液，将试管倒立于滤纸上吸去残余液体。向沉淀中分别加入双缩脲试剂及双缩脲空白试剂，再进行与上述相同的其他操作和计算。方法评价1.双缩脲显色反应仅和蛋白质中肽键数成正比关系，与蛋白质的种类、分子量及氨基酸的组成无明显关系，各种蛋白质的显色程度基本相同。2.本法重复性好，RCV为4%，CCV为3.9%；线性范围为0140g/L；本法干扰少，并且大多可以避免；使用单一的稳定试剂，操作简便、快速，既适于手工操作，也便于自动化分析，已被推荐为测定血清总蛋白的参考方法。3.唯一的缺点是灵敏度较低，比酚试剂法低约100倍。但本法的检出限为0.21.7g/L，这相当于70g/L的血清324l，已能满足临床生化检验的需要。4.本法是临床测定血清总蛋白质首选最方便、最实用的常规方法。5.临床上常见的血清蛋白定量法主要有双缩脲法、临床折射计法、染料结合法、BCA法和免疫比浊法。临床意义 血清总蛋白浓度受到血容量变化的影响，脱水时蛋白浓度相对增加，水潴留时则降低。在生理情况下，体位、运动等也可使血蛋白浓度发生轻微变化。 1.血清总蛋白浓度升高 （1）各种原因失水所致的血液浓缩：如呕吐、腹泻、烧伤、糖尿病酮症酸中毒、急性传染病、急腹症等。 （2）网状内皮系统疾病：如多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症、单核细胞性白血病等； （3）风湿性疾病：如系统性红斑狼疮、多发性硬化。 （4）慢性传染病：如结核、梅毒等 2.血清总蛋白浓度降低 （1）各种原因引起的血清蛋白丢失或摄入不足：如肾病综合征、营养不良、消耗增加； （2）蛋白质合成障碍，如肝脏疾病。 血清白蛋白测定血清白蛋白溴甲酚绿法测定实验：实验原理：在pH42的缓冲液中，白蛋白作为一种阳离子，结合阴离子染料溴甲酚绿（BCG）形成蓝绿色化合物，在波长630nm处有吸收峰，其吸光度与白蛋白浓度成正比例，与同样处理的白蛋白标准液比较可求得血清中白蛋白含量。实验试剂1、05molL琥珀酸缓冲贮存液（PH40）溶解Na0H 10g琥珀酸 56g于 800m1蒸馏水中，用1molL氢氧化钠调至pH4.10.05加水稀释至1000ml此液置4冰箱保存2、BCG已存液（10molL）：溶解BCG（MW720.22）1.80g于5m1 Na0H中用蒸馏水稀释至250ml3、叠氮钠贮存液：溶解叠氮钠40g于1000ml蒸馏水中。4、聚氧化乙烯月桂醚（BYij35）贮存液溶解2.5g聚氧化乙烯月桂醚于80ml蒸馏水中，加热助溶然后加蒸馏水至10ml5、BCG试剂：与1L容量瓶中盛蒸馏水约400m1，加琥珀酸缓冲贮存100ml，用吸管准确加入BCG贮存液80m1，并用蒸馏水将吸管壁上残留的少量染料冲洗到液体中加叠氮钠25ml，聚氧化乙烯月桂醚25ml最后用蒸馏水稀释到刻度，配好BCG试剂应为4.15土0.05。6、40gL白蛋白标准应用液实验步骤 波长630nm。用空白管调零，用定量加液器加BCG应用液与血清标本混合后，立即在30土3S，读取吸光度，如果标本混浊可做标本空白管（血清002m1加琥珀酸缓冲液40ml）以琥珀酸缓冲液调零测定标本空白管吸光度，测定管吸光度减去标本空白管吸光度后计算结果测定管标准管空白管待测血清白蛋白标准液蒸馏水BCG应用液计算：血清白蛋自（gL）测定管吸光度标准管吸光度标准管白蛋白浓度（g/L）同时测定血清标本的总蛋白浓度，减去血清白蛋白浓度，即得血清球蛋白浓度，并可计算血清白、球蛋白比值参考值：3555g/L注意事项：1、实验证明BCG不但与白蛋白显色，而且与各种蛋白成分显色其中以球蛋白、转铁蛋白、融珠蛋白更为显著，其反应度较该蛋白稍慢，故有人主张用定值参考血清作标准比较理想，BCG与血清特异结合后，在此30秒读取吸光度，可明显减少非特异性结合反应.2、当60g/L