常见猪病PCR检测操作步骤及试剂配制.doc

_常见猪病PCR检测操作步骤及试剂配制一、 RNA病毒（蓝耳病、猪瘟、乙脑、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、轮状病毒等）包括病料的处理、RNA的提取、反转录、和PCR扩增、凝胶电泳四个步骤。1、 病料的处理取组织病料约2克，加入4-5毫升灭菌的PBS或者生理盐水，置研磨器（灭菌）中研磨或者用剪刀细心剪碎，置-20中反复冻融三次，即可用于检测。2、 RNA的提取1） 取上述冻融三次的病料约200微升置1.5毫升的离心管中，加入500-600微升TRIzol剧烈振摇30秒后，静置5分钟后，再次剧烈振摇30秒后，静置5分钟。2） 在加入200微升的氯仿，上下颠倒混匀30s，静置5分钟，4 12000g离心15 min。离心完毕后，取上清约400-500微升（注意不要吸到中间层白色物质）置新的灭菌好的离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒数次后（不可剧烈震动）静置10分钟，4 12000g离心10 min.可见管底部有少量白色沉淀，倒掉异丙醇，加入1毫升75的乙醇（DEPC水配制），振摇，将白色沉淀悬浮，4 7500g离心5 min。弃去上清，干燥沉淀物（将离心管倒置于卫生纸或者其它吸水纸上，室温约5 min即可）加入20LDEPC水溶解用于RT-PCR，或于-20保存备用。两步法：1、反转录 在10L的反转录体系中加入： 上述步骤中提取的RNA7L、5Buffer 2L、10 mM dNTP 0.25L、Oligo (dT)18 0.5L或者下游引物0.5L；6510分钟，迅速放置-20摄氏度冰箱中2分钟，加入M-MLV 100U/L 0.25L（反转录酶） 37水浴1h,即可做为PCR扩增的模板，立即用于PCR扩增或置于- 20 保存备用。2、PCR扩增设立阳性和阴性对照，阳性对照一般为病毒液，阴性对照用灭菌的双蒸水做为PCR反应模板。反应总体系为25LcDNA 2L，（模板）25mmol/L Mg2+ 1.5L，2.5mmol/L dNTPs 2.0L，10 Mg2+ free PCR Buffer 2.5L，20mmol/ L上下游引物各1L，Taq DNA聚合酶(5U/L)0.2L无菌双蒸水补至25.0L。PCR反应条件为：94预变性3 min；94 45s，56 45s，72 45s，共进行36个循环；最后72延伸10min。（根据不同的病毒设定时间和温度）一步法：采用的是TaKaRa 的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒在25uL反应总体系： PrimeScript 1 Step Enzyme Mix , 1uL 2 1 Step Buffer ， 12.5uL RNase Free dH2O ,6.5ul 20mmol/ L上下游引物各1L， 提取的RNA模板：3ul反应条件：50反转录30min，94预变性2min，进行30个循环（94变性1min，56退火1min,72延伸1min）, 最后72延伸10min。扩增完的PCR产物放4保存。3、 凝胶电泳1%琼脂糖凝胶的配制0.25琼脂糖+25毫升TAE+1.25微升Goidview放入锥形瓶中，置烤箱中约1分钟沸腾后，摇匀，放置室外，约20-30分钟后倒入板中，约30-45分钟凝固后即可使用。点样：将凝胶放入电泳槽中，DL2000的DNA Marker3-5微升，其它样品5微升+0.5-1微升的londingbuffer混合后点样，开启电泳仪，电压80-150V。4、 PCR 产物回收纯化取20L PCR产物与4L 6Loading Buffer混匀，1%琼脂糖凝胶（GoldView 0.5ug/ml）电泳。电泳结束后，在紫外灯下切出含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的电泳缓冲液，此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的多余凝胶以减小凝胶体积，从而提高DNA的回收产率。之后按照胶回收试剂盒产品说明书回收目的片段，并取1L回收产物点样观察回收效果。纯化步骤如下：(1) 称量胶块重量，计算胶块体积，按照1mg等于1L计算胶块体积；(2) 向胶块中加入3倍胶块体积的融化液DR-I Buffer；(3) 均匀混合后65水浴10 min，其间摇晃3-5次使胶块完全溶化；(4) 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer 0.5倍体积量的DR-II Buffer，均匀混合；(5) 转移液体至Spin column中，12,000 rpm 离心1min，弃滤液（可将滤出液体回收再离心一次以提高DNA回收率）；(6) 将500ul 的RinseA加入Spin column 中，12,000 rpm 离心30s，弃滤液；(7) 将700 ul 的Rinse B加入Spin column 中，静置23 min，12,000 rpm 离心30s，弃滤液；(8) 重复上一步操作；(9) 10,000 rpm，离心1min，弃滤液；(10) 将Spin column 安置于一灭菌的1.5ml Eppendorf管中，在滤膜中央处加入灭菌双蒸水或者试剂盒中的洗脱缓冲液20-30微升，室温静置12 min；(11) 12,000 rpm 离心1min，收集滤出液体再离心洗脱一次，即得到纯化的PCR产物。注：PCR纯化产物可直接用于测序，如用PCR回收产物直接测序时，回收第10步中不可用洗脱缓冲液，只可用双蒸水。5、 DNA病毒（PCV2、伪狂犬病毒、细小病毒等）包括病料处理、DNA的提取和PCR扩增、凝胶电泳四个步骤。1、 病料处理同上2、 DNA的提取1） 取处理好的病料约1毫升置1.5毫升的离心管中，12000 rpm/min离心五分钟，取上清液（500-700l）.缴入等体积的氯仿剧烈振摇静止5分钟，12000 rpm离心10分钟，2） 去上清至新的离心管中，加入终浓度为分别为10% 的SDS（约50微升）和50g/ml蛋白酶K（约10微升），55作用1.5h-2h（提前准备好水浴锅）。3） 加入200uL Tris饱和酚，振荡混匀，4，12000 rpm/min离心15min；4） 取上清液，于一个新的离心管中，加入Tris饱和酚和氯仿各200uL，充分混匀， 12000 rpm/min离心15min；5） 取上清于一新的离心管中，加入200uL氯仿，充分混匀，12000 rpm/min离心15min；6） 去上清于新的离心管中，加入2倍体积无水乙醇，-20放置20min, 12000 rpm/min离心15min，弃上清。(无水乙醇提前冰浴)7） 加入70%的乙醇（提前放入冰箱）冲洗沉淀表面和管壁，弃乙醇，晾干。（若无沉淀可以离心7500 rpm/min离心5min；8） 最后加入20l 无菌ddH2O溶解，-20保存备用。3、PCR扩增设立阳性和阴性对照，阳性对照一般为病毒液，阴性对照用灭菌的双蒸水做为PCR反应模板。反应总体系为25LcDNA 2L，（模板）25mmol/L Mg2+ 1.5L，2.5mmol/L dNTPs 2.0L，10 Mg2+ free PCR Buffer 2.5L，20mmol/ L上下游引物各1L，Taq DNA聚合酶(5U/L)0.2L无菌双蒸水补至25.0L。PCR反应条件为：94预变性3 min；94 45s，56 45s，72 45s，共进行36个循环；最后72延伸10min。（根据不同的病毒设定时间和温度）3、 凝胶电泳同上4、 PCR产物的纯化回收以及测序同上。试剂配制1、DEPC水的配制 向灭菌的玻璃瓶中加入超纯水，然后加入DEPC至终浓度为0.01%（V/V）过夜搅拌（放置摇床中），高压灭菌即可。2、病料处理用PBS的配制NaCl: 8.00gKCl: 0.20gNa2HPO4 1.42 gKH2PO4 :0.27g向烧杯中加入800毫升去离子水，充分搅拌，用浓盐酸调节PH至7.4，加入去离子水定容至1升，高压灭菌后即可使用。1、 TAE电泳液1)50TAE贮存液：Tris242g，冰乙酸28.5 ml和Na2EDTA.2H2O 37.2混合，向烧杯中加入800毫升去离子水，充分搅拌，加入57.1毫升醋酸，充分搅拌，加入去离子水定容至1升，室温保存。(2)1TAE工作液：50TAE贮存液20 ml，加纯水定容至1000 ml。4、10%SDS：10gSDS置于100-200ml烧杯中，加入80ml的去离子水，68溶解，调PH7.2,早定容100ml.5、dNTP Mixture、ExTaqDNA聚合酶、TRIZOL等试剂均购自Invitrogen公司; M-MLV购自Promega公司。DL2000的DNA Marker , 一步法的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒购自TaKaRa公司。Tris饱和酚，购自Solarbio。检测用的引物：1.蓝耳：上游：JN1 5 CGGTTTTGATGGGCGACA 3 下游：JN2 5 TGCAGGCGTGCGAGGTAA 3退火温度：53-56检测缺失毒株用2.猪瘟检测疫苗毒用上游：HCV1 5AAACGGAGGGACTAGCCGT 3下游：HCV2GATTCAACTCCATGTGCCATG退火温度：56检测野毒上游：CSFV15-ACCTAATCTTACACTATGCAATC-3下游：CSFV25-CTGGACTAGTCCCATCAAAT-3退火温度：51-54 3.传染性胃肠炎上游： TGEV1 5-GATGGCGACCAGATAGAAGT-3下游： TGEV2 5-GCAATAGGGTTGCTTGTACC-3退火温度：51 4.流行性腹泻上游：PEDV1 5- GAAATAACCAGGGTCGTGGA-3下游：PEDV2 5-GCTCACGAACAGCCACATTA-3退火温度：51 5.乙脑上游：JE -1 5 AACAGCATGCAAATCGAAGAC3下游：JE- 2 5 CCAGAAACATCACCAGAAGG3退火温度：55 6.伪狂犬上游：PRV-gB-F 5CGTCGAAGTACACGTACCCG3下游：PRV-gB-R 5CTC