蒸发光散射检测器.ppt

蒸发光散射检测器 ELSD 在药物分析中的应用 中国药品生物制品检定所mash 概述 HPLC ELSD测定抗生素含量的方法将被收入2005版中国药典ELSD可以对所有挥发性低于流动相的物质作出准确检测 而与被检测物质的化学基团关系不大 物理性质类似的物质响应一致 响应值与样品的质量成正比 ELSD作为一种新型检测器 其理论知识和实践应用仍在不断发展中 背景 检测器的作用是将色谱柱流出物中样品含量的变化转换为可供观测的信号 通常是转换为电信号 以便自动记录下来进行定性定量分析 传统检测器分为 通用型检测器和选择性检测器 针对传统检测器的局限性 近年来 质谱 MS 和蒸发光散射检测技术 ELSD 被列入高效液相色谱检测技术行列 主要内容 1蒸发光散射检测技术2响应特性3实验条件选择与优化4定量计算5应用实例 第一部分蒸发光散射检测技术 蒸发光检测器工作原理蒸发光检测器构造与操作模式蒸发光检测器基本特点蒸发光检测器的应用优势 1 1蒸发光散射检测器工作原理 检测三步曲 雾化 蒸发 检测 检测三步曲示意图 1 2ELSD构造与操作模式 A型 所有液滴进入漂移管及流动池 又称 无气溶胶分流NoAerosolSplitting B型 部分液滴分流排掉 只有一部分进入漂移管及流动池 气溶胶分流AerosolSplitting A型蒸发光散射检测器示意图 B型蒸发光散射检测器示意图 两种操作模式的应用区别 A型操作模式通常使用比较高的操作温度 较适合于高有机含量和低流速流动相 A型仪器通常灵敏度更高一些 B型操作模式在较低的操作温度下效果较好 在使用高含水 高流速流动相时 B型ELSD通过分流可以得到相对稳定的基线 在实际应用中采用何种模式ELSD 取决于样品的性质和实验目的 1 3ELSD的基本特点 蒸发光散射检测器的检测结果是一个受多因素影响的综合结果 仪器设计 化合物性质 实验条件的选择 载气流速 漂移管温度 流动相组成 灵敏度检测限与定量限稳定性与重现性线性 1 3ELSD的基本特点 1 3 1灵敏度 灵敏度是指测量响应除以对应的输入量变化灵敏度实际上就是响应值 浓度 或样品量 关系作出的直线的斜率 斜率越大则灵敏度越高 ELSD响应曲线 1 3 2检测限与定量限 检测限 取信噪比为3 即以噪声的3倍作为最小可检测的信号 定量限 取信噪比为10 即以噪声的10倍作为最小可准确定量的信号 某种化合物在ELSD中的检测限并不固定不变 它可能随着实验条件的改变而变化 通常在10 几百ng ELSD响应曲线 1 3 3稳定性与重现性 在常规实验中 以进样精密度反映出来的ELSD稳定性 通常RSD 2 ELSD重现性通过随行标准曲线能够有效保证 ELSD可以满足一般定量要求 线性范围是指灵敏度保持不变时样品的最大用量与最小用量之比 反映在检测器响应曲线上就是保持直线线段的样品量变化范围 即检测器输出信号与样品呈线性关系 1 3 4线性 1 3 4线性 所有的液相色谱检测器都有一定的线性范围 用方程表示为 当x 1时 为线性响应 但对常用的检测器来说 仅在某一范围内接近于1 实际只要在0 98 1 02范围内 即可认为是线性 ELSD线性特征 线性不过零点线性范围较窄低浓度非线性 1 3 5ELSD与其它HPLC检测器的比较 1 4ELSD的应用优势 对无特征紫外吸收或只有紫外末端吸收的大分子有机化合物的检测 显示出极大的优越性 简化了样品的预处理过程 缩短了分析时间 基线稳定 样品检测灵敏度高 流动相的蒸发使得ELSD和梯度洗脱相容 可以提高色谱分离的分辨率并缩短分析时间 只需一个标准品就可定量两个或更多的未知品 因此可以通过和内标比较来定量未知化合物 此特性对于组合化学中用组合技术合成的化合物的定量尤其有用 所选的未知物结构相似而分子量不同 定量准确性更高 1 4ELSD的应用优势 UVD 定量未知化合物是很困难的 样品的紫外吸收值往往和代表样品质量的色谱峰大小无关 ELSD 其响应不依赖于样品的光学特性 代表了样品的组成 检测信号更为直接的代表样品的真实浓度 与样品的质量浓度呈正比 因而能用于测定样品的纯度或检测未知物 1 4ELSD的应用优势 ELSD的一些性能指标虽然还不能与某些更成熟HPLC检测器相比 但ELSD的检测原理在某些方面有其独到之处 认真分析ELSD的有关特点 合理运用 将不利因素的影响降低到最低程度 提高准确度 精密度和重现性 1 4ELSD的应用优势 第二部分ELSD的响应特性 响应特性是指在确定条件下 输入值与对应响应之间的关系 通用性响应因子的一致性ELSD的剂量响应关系曲线 2 1通用性 蒸发光散射的响应值与被测物质的官能团和光学性质无关 故可用于对各种物质的检测 散射光的响应值与粒子质量的关系 I kmb取对数 lgI blgm lgkm 待测组分的粒子质量和I 待测组分所产生的散射光光强k b 常数 2 1通用性 验证 分别精密称取基准氯化钠 麦迪霉素 雷帕霉素 头孢硫眯 妥布霉素适量 溶解并稀释至不同的浓度后 采用离柱分析 进样后 记录其色谱行为 以峰面积对样品量作出各种物质在ELSD中的响应曲线 2 1通用性 响应值与物质结构 2 1通用性 响应值与物质结构 2 1通用性 响应值与物质结构 不同物质的量值响应曲线的斜率与物质的本身结构有关 通用性 物质结构对响应值的贡献 头孢羟氨苄头孢氨苄阿莫西林 羟氨苄西林 氨苄西林以经称量和含量校正后的峰面积作为响应因子 R H 为头孢氨苄 R OH 为头孢羟氨苄 通用性 物质结构对响应值的贡献 R H 为氨苄西林 R OH 为阿莫西林 通用性 物质结构对响应值的贡献 通用性 物质结构对响应值的贡献 通用性 物质结构对响应值的贡献 羟基引入 分子极性增强 ELSD响应值增加 分子极性对ELSD影响较大 通用性 物质结构对响应值的贡献 头孢拉定 通用性 物质结构对响应值的贡献 通用性 物质结构对响应值的贡献 头孢氨苄 通用性 物质结构对响应值的贡献 头孢克洛 通用性 物质结构对响应值的贡献 Ceftezole R Hcefazolin R CH3 通用性 物质结构对响应值的贡献 通用性 物质结构对响应值的贡献 西林中的五元N S杂环变为头孢中的六元环 引起ELSD响应值大幅度增加 其原因可能涉及原子排布变化 引起分子极性分布和分子体积变化有关 这些因素也可能影响分子的聚集和所形成颗粒的大小 通用性 物质结构对响应值的贡献 2 1通用性 不同类别的化合物在ELSD中均有良好的响应 证实了ELSD的通用性不同化合物在ELSD中响应值不同 说明ELSD响应值与化合物本身的结构 或物理性质 有关 2 2响应因子一致性 不同的物质在蒸发光散射检测器中几乎具有相同的响应因子 这种响应因子的一致性 使纯度分析结果和多组分物质的相对比例测定结果更准确 在无合适对照品的情况下 采用另外一种含量已知的物质作内标 测定未知物含量成为可能 氨基糖甙类抗生素大环内酯类抗生素四环类抗生素喹诺酮类抗生素 内酰胺类抗生素 2 2响应因子一致性 响应因子一致性 大环内酯类 十六元环大环内酯类抗生素麦迪霉素 麦迪霉素A1 麦白霉素吉他霉素 响应因子一致性 大环内酯类 响应因子一致性 大环内酯类 盐酸四环素土霉素盐酸美他环素 响应因子一致性 四环类抗生素 四环素R1 CH3OHR2 H土霉素R1 CH3OHR2 OH美他环素R1 CH2R2 OH 响应因子一致性 四环类抗生素 响应因子一致性 四环类抗生素 阿米卡星 丁胺卡那霉素 西索米星奈替米星依替米星威替米星 响应因子一致性 氨基糖苷类 阿米卡星 响应因子一致性 氨基糖苷类 1硫酸盐2阿米卡星3西索米星4奈替米星5依替米星6威替米星 响应因子一致性 氨基糖苷类 校正线性方程 Amikacin y 1 46x 5 07 r 0 9997Sisomicin y 1 51x 5 03 r 0 9997Netilmicin y 1 52x 4 88 r 1 0000Etimicin y 1 46x 4 85 r 0 9999Vertilmicin y 1 41x 4 90 r 0 9998斜率的RSD 2 92 响应因子一致性 氨基糖苷类 响应因子一致性 氨基糖苷类 依诺沙星 Enoxacin 左氧氟沙星 Levofloxacin 环丙沙星 Ciprofloxacin 洛美沙星 Lomefloxacin 加替沙星 Gatifloxacin 响应因子一致性 喹诺酮类 依诺沙星左氧氟沙星 响应因子一致性 喹诺酮类 环丙沙星洛美沙星 响应因子一致性 喹诺酮类 加替沙星 响应因子一致性 喹诺酮类 流动相 0 5 三乙胺水溶液 三氟醋酸调pH2 5 0 1 乙腈 48 12 流速 0 6ml min混合溶液 用重蒸水溶解并稀释至刻度 制成各对照品经含量校正后终浓度约为2g L的混合液 响应因子一致性 喹诺酮类 1依诺沙星2左氧氟沙星3环丙沙星4洛美沙星5加替沙星 响应因子一致性 喹诺酮类 依诺沙星Y 1 0799X 2 7611r2 0 9996左氟沙星Y 1 0913X 2 7235r2 0 9997环丙沙星Y 1 0828X 2 7523r2 0 9994洛美沙星Y 1 0891X 2 7391r2 0 9993加替沙星Y 1 0878X 2 7392r2 0 9995斜率的RSD 0 43 响应因子一致性 喹诺酮类 头孢氨苄头孢克洛头孢拉定头孢唑啉头孢替唑 响应因子一致性 内酰胺类 响应因子一致性 内酰胺类 响应因子一致性 内酰胺类 响应因子一致性 内酰胺类 总体上讲 不同化合物在ELSD中较之于其它类型检测器有更接近的响应 证实了ELSD响应的一致性 实验结果也显示 随着化合物之间结构相似性的减小 其ELSD响应差异增大 2 2响应因子一致性 2 3ELSD的剂量响应关系曲线 在较高浓度范围 ELSD的剂量响应关系为直线在低浓度范围 ELSD的剂量响应关系呈二项式曲线 2 3ELSD的剂量响应关系曲线 x0 最低检出限 0 y m y kx m 曲线部分 较高进样量的响应曲线 较高进样量的响应曲线 低浓度范围ELSD剂量响应关系考察 低浓度范围ELSD剂量响应关系考察 低浓度范围ELSD剂量响应关系考察 低浓度范围ELSD剂量响应关系考察 进样量较小时 ELSD的线性较差 双对数线性方程线性在一些品种中略优于直接线性方程 在较低进样量时 进样量 峰面积的多项式拟和方程相关性更佳 R2 0 999 低浓度范围ELSD剂量响应关系考察 不同种类或不同结构的抗生素均能在一定范围内 高低浓度相差5倍以上 在ELSD获得良好线性 R2 0 999 在较高浓度范围 ELSD的剂量响应曲线或拟合的双对数曲线呈现良好的直线关系 在较低进样量时 剂量响应的多项式拟和方程的相关性更佳 2 3ELSD的剂量响应关系 3实验条件选择与优化 对ELSD的工作原理 基本特点和响应特性的认识 可以为ELSD实验条件的选择和优化提供依据 如何根据ELSD的特点 扬长避短 建立一个良好的HPLC ELSD实验方法 3实验条件选择与优化 影响HPLC ELSD实验结果的因素和优化方法HPLC ELSD实验方法评价标准 参照一般HPLC方法评价要求 3实验条件选择与优化 3 1HPLC部分一般条件3 2载气流速与漂移管温度3 3流动相组成3 4进样量 3 1HPLC部分一般条件 ELSD从应用角度讲 要取得较好的HPLC ELSD测定结果 首先要求所选择的ELSD灵敏 低噪声 稳定 抗干扰能力强 易于检修 清洗和维护 3 1HPLC部分一般条件 泵最好采用低脉冲输液泵 采用双泵时尤其注意比例阀的精度和重现性 3 1HPLC部分一般条件 色谱柱较适宜于采用微径 低流量 高柱效色谱柱 以提高信噪比 可以通过选择色谱柱弥补流动相选择的局限性 3 1HPLC部分一般条件 载气首选氮气 干燥 无尘 气流稳定 流速按推荐条件优化 3 1HPLC部分一般条件 漂移管温度视流动相组成 按推荐条件优化 3 1HPLC部分一般条件 测量模式根据样品特性和流动相情况选择 3 1HPLC部分一般条件 流动相新鲜配制 重蒸水 HPLC级试剂 组成均一恒定 尽量无盐 3 2载气流速与漂移管温度 载气流速和漂移管温度是ELSD中可以调节的两个重要参数 建立适当的HPLC ELSD分析方法需要对这两个参数进行优化 优化的原则是降低噪声到可以接受的程度 并尽量提高信噪比 通常按厂家提供的检测器条件推荐值及优化步骤 以0 5mV为最低可接受噪声限度 分别对漂移管温度 载气流速进行优化 3 2载气流速与漂移管温度 漂移管温度对基线水平和噪音的影响并无明显的规律性 低于某一温度 基线水平较高 因为低于这一温度 流动相得不到充分挥发 而盐的加入将会提高这一温度 因为盐的挥发需要更高的温度 但并不是漂移管温度越高越好 因为温度太高会使流动相沸腾 反而会增加背景噪音 同时还有可能导致溶质的部分挥发 降低信噪比 故最优温度应为在流动相 包括其中所含的盐 基本挥发的基础上 产生可接受噪音的最低温度 3 2载气流速与漂移管温度 一般来说 在其它条件不变的情况下 载气流速越小 形成的物质粒子半径越大 对激光的散射能力越强 相应的响应信号越大 但并不是载气流速越小越好 因为当载气流速太小时 流动相不能完全挥发 背景噪音会增加 信噪比也会降低 最优载气流速应是在可接受噪音的基础上 产生最大检测响应值时的最低流速 3 2载气流速与漂移管温度 图3 1漂移管温度优化图3 2载气流速优化 以氨基糖苷类抗生素的测定为例 优化结果见下图 3 2载气流速与漂移管温度 实验结果表明 漂移管温度为110 噪音低于0 5mV 而当漂移管温度降至105 时 噪音则增至1 5mV以上 故漂移管温度设为110 载气流速优化时发现 载气流速大于或等于2 80L min时 噪音水平均在0 2mv左右 而蒸发光散射检测器的原理决定 载气流速越小 形成的物质粒子越大 相应的响应值越大 故载气流速选择了2 80L min 3 3流动相组成 限制蒸发光散射检测器应用的主要因素是样品组分和流动相的挥发性 样品组分应是非挥发性或半挥发性的 流动相应是易挥发的溶剂 如果流动相中需使用缓冲溶液 缓冲盐必须具有挥发性 且浓度应尽可能低 常用的HPLC ELSD流动相添加剂有甲酸 乙酸 三氟乙酸 乙酸铵和磷酸氢二铵缓冲液等 流动相组成的改变或添加某些盐类可能会对响应造成影响 3 3流动相组成 3 3 1流动相组成改变对ELSD响应值的影响3 3 2关于 挥发性盐 3 3 1流动相组成改变对ELSD响应值的影响 ELSD响应值是一个受多因素影响的结果 在相同条件下 短时间连续多次进样 ELSD峰面积一般相差较小 RSD 2 表明现有仪器条件已能较好地控制相关因素 保证响应值的稳定重现 但是值得注意的是 流动相的组成与ELSD响应有关 在常用的反相HPLC ELSD中 多以有机相与水相混合为流动相 随着有机溶剂挥发 试剂瓶内流动相组成将发生改变 这是否会对ELSD的响应值有影响 其影响与UVD相比有多大 3 3 1流动相组成改变对ELSD响应值的影响 1 改变流动相组成对UV及ELSD响应值影响的比较在同一色谱系统中 分别在4个不同流动相条件下 以同一麦迪A1和交沙霉素样品进样 进样量均为20ul 麦迪A1进样量为4 1152 g 交沙霉素进样量为4 6816 g 同时记录ELSD及UV色谱峰面积 在4个不同流动相条件下 麦迪A1和交沙霉素ELSD峰面积RSD分别达到31 3 和41 7 而其UV峰面积RSD仅仅分别为1 8 和1 5 基本保持不变 图3 3A B 另以较高浓度麦迪A1同法进样 进样量为20 576 g 记录ELSD色谱峰面积RSD为19 6 3 3 1流动相组成改变对ELSD响应值的影响 1 改变流动相组成对UV及ELSD响应值影响的比较 图3 3A不同有机相含量下麦迪A1及交沙霉素UV峰面积变化图 3 3 1流动相组成改变对ELSD响应值的影响 1 改变流动相组成对UV及ELSD响应值影响的比较 图3 3B不同有机相含量下麦迪A1及交沙霉素ELSD峰面积变化图 3 3 1流动相组成改变对ELSD响应值的影响 2 流动相组成改变对ELSD响应影响的模拟计算在上述实验结果中 分别以交沙霉素和两个进样量条件麦迪A1的ELSD峰面积对相应流动相中有机相含量进行直线回归 线性方程如图3 4 表明各ELSD响应随有机相比例减少而降低 在各方程中 分别以50 流动相有机含量的峰面积为基础 模拟有机相改变1 计算各响应值漂移 表3 2 可见不同化合物 交沙霉素和麦迪A1 响应值漂移不同 而较高进样量 麦迪A1 有助于降低响应值漂移 3 3 1流动相组成改变对ELSD响应值的影响 2 流动相组成改变对ELSD响应影响的模拟计算 图3 4不同进样量的麦迪A1以及交沙霉素ELSD峰面积与流动相中有机相含量线性方程 3 3 1流动相组成改变对ELSD响应值的影响 2 流动相组成改变对ELSD响应影响的模拟计算 表3 2流动组成微小变化对ELSD响应影响的模拟计算结果 3 3 1流动相组成改变对ELSD响应值的影响 3 讨论上述实验表明 流动相组成的改变对UVD的响应值几乎没有影响 但却能造成ELSD响应值明显漂移 提示在ELSD使用过程中应严格保持流动相组成恒定 对照品与样品进样应该交叉进行 校正曲线应随行制作 这些可能有助于减小实验误差 如果出现保留时间较大漂移 样品浓度差异因素除外 应注意流动相组成的改变 3 3 1流动相组成改变对ELSD响应值的影响 3 讨论由此也可以推知 一直认为梯度洗脱用于ELSD时 由于流动相的完全挥发 基线不发生漂移 这是HPLC ELSD在应用上的一大优势 可是 虽然基线不漂移 但由于梯度的重现性较差 流动相组成不稳定而造成响应漂移 应该是一个值得慎重考虑的问题 使用过程中应重视梯度的稳定性 3 3 1流动相组成改变对ELSD响应值的影响 3 讨论实验同时表明 进样量增大4倍 ELSD响应值漂移减小了40 提示ELSD用于较高浓度的常量分析 流动相引起的响应漂移误差较小 3 3 2关于 挥发性盐 不少文献和ELSD宣传材料中经常提到 挥发性盐 这个名词 顾名思义 即是在一定条件下可以转变成气体的盐类 汽化或分解 这是因为在某些情况下 为了保证被分析样品的有效分离 需要在流动相中添加盐类 使其具有一定的缓冲能力和离子强度 但根据ELSD的原理 流动相中不宜采用盐类 为了解决这一矛盾 人们希望这些必须添加的盐类 可由能在ELSD中 挥发 掉的 挥发性盐 所代替 在ELSD使用条件下可以汽化的盐类一般很少用于HPLC流动相 通常考虑在该条件下能够分解的盐类 如NH4Ac 3 3 2关于 挥发性盐 根据ELSD的应用特点 在选择 挥发性盐 时应该注意如下问题 1 挥发时效问题 2 流动相挥发性检验方法 1 挥发时效问题 虽然有些盐类按理论讲 能够在ELSD漂移管适用温度限度范围内分解 但是流动相从雾化口 漂移管到达检测窗口是一个时间很短的过程 1 挥发时效问题 例如 采用2 5L min的雾化载气流速 流动相通过雾化口到达检测窗口的时间可能不到10秒 Alltech2000 在如此短暂的时间内 挥发性盐 的挥发效率值得思考 比如上文提到的NH4Ac 通过TGA分析发现 NH4Ac从25 140 持续失重 直至完全分解 并无特征分解温度 见图3 5 1 挥发时效问题 图3 5NH4Ac在TGA中的失重曲线 25 150 1 挥发时效问题 ELSD漂移管最大耐受温度为120 Alltech2000 TGA分析发现 NH4Ac在该温度下失重速率仅为2 10s左右 见图3 6 1 挥发时效问题 图3 6NH4Ac在120 时的失重速率 TGA法 2 流动相挥发性检验方法 如何估计或验证流动相添加组份在ELSD中的挥发与否 以及这些成分对仪器灵敏度的损失程度呢 一个简单的办法是在不含该组分的阴性流动相中离柱注射含有该组分的溶液 从ELSD的响应值判断是否值得采用该流动相方案 2 流动相挥发性检验方法 例如 以甲醇 水 1 1 为流动相 流速1 0ml min 以50 甲醇水溶液分别稀释配制20mmol L与4mmol L的NH4Ac溶液 各取20 l注入ELSD Alltech2000 载气为2 5L min氮气 漂移管温度100 记录色谱图 见图3 7 在图中 20mmol L的NH4Ac溶液信噪比大于10 4mmol L的NH4Ac溶液的信噪比大于3 2 流动相挥发性检验方法 图3 720mmol L与4mmol LNH4Ac溶液在ELSD离柱分析中的色谱叠加图 2 流动相挥发性检验方法 由此可见 在甲醇 水 1 1 中添加20mmol L浓度NH4Ac的流动相 NH4Ac并不完全挥发 而是可以造成基线 Baseline 上抬10mV左右 这对于检测信号达到100mV以上的主成分分析可能影响不大 但对于含量较小的有关物质检测是否造成影响 可能需要进一步实验研究 关于 挥发性盐 应用小结 由于 挥发性盐 在ELSD中挥发效率较低 此外 液滴在漂移管行进过程中 雾化液滴中低沸点成分 如有机相 水 的挥发带走汽化热 液滴 颗粒 的实际温度可能低于漂移管温度 挥发性盐 则更难挥发 不挥发的盐类将造成检测器噪音升高 甚至污染检测器 关于 挥发性盐 应用小结 在必要的情况下 如果通过损失一定的灵敏度 外加及时清洗检测器 某些盐类仍然可以用作HPLC ELSD流动相组分 已有采用含盐流动相取得较好实验结果的实例 但是这要求ELSD仪器制造商在仪器清洗 以及减少盐类在检测器中的沉积等方面有专门的设计 3 4进样量 由于ELSD在不同剂量段的响应曲线存在差异 尤其在较低剂量段响应曲线非线性 而且其最低检测能力较低 即最低检测限较大 所以要想取得准确的定量结果 以及提高微量组分的检测能力 进样量也是HPLC ELSD实验条件的优化因素之一 3 4进样量 通常 在建立HPLC ELSD含量测定方法时 可以在色谱柱承受限度范围内采用较高进样量 以有利于获得较好线性和减小定量分析误差 3 4进样量 在建立HPLC ELSD有关物质含量测定方法时 一方面要通过色谱柱 流动相 载气流速 漂移管温度等多个条件的优化 以提高信噪比 另一方面也要考虑加大进样量 进一步提高有关物质或小组分的检测能力 4定量计算 由于ELSD的工作原理和响应特点 决定了HPLC ELSD采取的定量计算方法有别于一般HPLC定量方法 4定量计算 单点校准与多点校准法随行标准曲线直线模型与非线性模型分段线性方程 单点校准与多点校准法 单点校准法 又称外标法 是目前普遍采用的色谱定量方法 如HPLC UVD 外标法是基于物质量与响应成正比例 即响应直线经过原点 当对照品与样品响应值接近时 利用二者的响应值与对照品的含量计算供试品含量的一种简化方法 单点校准与多点校准法 ELSD线性方程不过原点 响应值与物质量不成正比例关系 单点校准与多点校准法 曲线部分 HPLC ELSD线性方程示意图 单点校准与多点校准法 UVD ELSD 单点校准与多点校准法 由于ELSD截距 除非实验中 否则供试品含量如仍按外标法公式计算 结果必然存在误差 而且将随与差异增大而增大 或者说是随对照品与样品浓度差异的增大而增大 在实际实验中 几乎无法做到 ELSD截距影响客观存在 使得HPLC ELSD不宜采用单点校准法 而应采用多点校准 即标准曲线法 进行定量计算 随行标准曲线 在仪器分析中 如果输入值与响应值之间的关系牢固不变 可以将校准值在较长时间内加以引用 而无需在每次测量时对仪器进行实时校准 对色谱分析而言 视各种影响因素而定 一般均在样品测定过程中采用单点或多点对照品随行实验 以消除一些影响因素 提高测量结果的重现性 随行标准曲线 由于ELSD的响应受多因素影响 所以随行标准曲线法是保证HPLC ELSD测定结果重现性的必要手段 直线模型与非线性模型 由于ELSD响应曲线的不确定性 在多点校准中究竟是采用直线模型还是非线性模型 一直是HPLC ELSD定量计算中最受争议的地方 直线模型与非线性模型 ToussaintB 等报道利用HPLC ELSD法测定3 叔丁胺基 1 2 丙二醇的对映异构体 直线模型与非线性模型 采用直接线性拟合 线性范围较窄为500 1000ug mly 1 3723x 0 1723R 0 9995 直线模型与非线性模型 采用对数法拟合曲线 线性范围较宽为50 1000 g mly 0 8564x1 5638R 0 9988 直线模型与非线性模型 采用二项式拟合曲线 线性范围最宽为50 1500 g mly 0 1349x2 1 7418x 0 0845R 0 9996 直线模型与非线性模型 例如 异帕米星供试品含量测定随行标准曲线的建立 直线模型与非线性模型 取0 3 0 4 0 5 0 6 0 7mg ml的对照品溶液 分别在供试品溶液进样之前和进样之后进样 记录色谱图 以峰面积 A 的对数 Y 对浓度 C 的对数 X 进行线性回归 所得线性方程为Y aX b 即 lgA algC b 直线模型与非线性模型 取供试品溶液 分别平行进样 测定供试品溶液主峰的平均峰面积 A 并由随行标准曲线计算供试品溶液中异帕米星的浓度 10 lgA b a 然后再根据供试品溶液的稀释 V 和称样量 W 计算供试品中异帕米星的含量 X 计算公式为 X 10 lgA b a V W 100 直线模型与非线性模型 也有不采用标准曲线的情况 AndrzejStolyhwo等报道 不同甘油三酯类物质 分子量 308 1064 的ELSD响应因子几乎相同 离柱分析与在线分析的响应因子一致 并与上述脂肪酸同系物响应因子一致的结论相符合 因而可不用标准曲线 按下式计算甘油三酯的含量 直线模型与非线性模型 式中Ci为第i个组分的浓度 Ai为第i个组分的峰面积 1 7为标准曲线的斜率 与该仪器的雾化装置有关 而与该组分的物理 化学性质无关 直线模型与非线性模型 所以 根据上述实验事实以及讲义前面的有关阐述 HPLC ELSD定量计算采用何种拟合曲线应视具体情况而定 如测定不要求太宽的线性范围 采用线性或对数曲线拟合即可 分段线性方程 ELSD是一种近质量型检测器 一般认为采用ELSD进行有关物质检查或纯度分析时 结果更接近物质的真实组成 优于紫外检测 但由于ELSD检测的响应值与进样量 或样品浓度 间并非完全线性关系 简单采用峰面积归一化法计算有关物质的含量或物质纯度是不科学的 分段线性方程 采用HPLC ELSD进行有关物质测定 其定量计算不仅要考虑上述截距 随行实验以及线性模型等因素 还应考虑线性范围 对于与主成分含量相差较大的有关物质和多组分样品中的低含量组分 应该采用分段线性方程 分段线性方程 在有关物质已知的情况下 通过绘制各物质的随行校正曲线 线性范围可选择主组分浓度的0 1 5 视具体情况而定 来分别标定各峰的绝对含量 主组分的含量通过主组分的标准校正曲线确定 在有关物质未知或组分较多时 也可选择一种或数种结构与主组分相似的物质绘制随行校正曲线 确定其相对含量 随行校正曲线有采用对数法 即logy alogx b 校正的 也可应用二次曲线法 即y ax2 bx c 校正的 应用实例 HPLC ELSD在药物分析中的应用有许多文献报道 此处仅以在几个氨基糖甙类抗生素分析中的应用简单加以说明 应用实例 硫酸阿米卡星质量标准的修订硫酸西索米星与硫酸奈替米星含量测定方法研究硫酸庆大霉素组分C组分含量测定方法HPLC ELSD法分析小诺霉素及其有关物质某未知氨基糖甙类抗生素 N1 N2 组分分析 硫酸阿米卡星质量标准的修订 中国药典2000年版采用微生物检定法测定阿米卡星的含量 而国外药典已经开始采用HPLC法进行阿米卡星含量测定 由于氨基糖甙类抗生素无紫外吸收 因此BP和EP采用衍生化方法 USP采用电化学检测器检测 硫酸阿米卡星质量标准的修订 浙江省药检所采用HPLC ELSD增修订中国药典中硫酸阿米卡星含量测定及有关物质测定方法 进行了详细的方法学研究 建立了HPLC ELSD法测定硫酸阿米卡星中阿米卡星及有关物质的方法 图5 1A 图5 1B 并采用该方法对多家企业及多批产品中阿米卡星与有关物质的含量进行了比较研究 实验结果意义十分显著 硫酸阿米卡星质量标准的修订 图5 1A硫酸阿米卡星与卡那霉素的分离图谱 图中依次为硫酸根峰 卡那霉素A峰 阿米卡星峰和卡那霉素B峰 硫酸阿米卡星质量标准的修订 图5 1B硫酸阿米卡星与杂质K29的分离图谱 图中依次为硫酸根峰 阿米卡星峰和杂质K29峰 硫酸阿米卡星质量标准的修订 色谱条件 Agilent1100高效液相色谱仪 DikmaTechnologiesSEDEX75蒸发光散射检测器 漂移管温度50 载气压力3 5bar 检测器GAIN值为4或7 以水 氨水 冰醋酸 96 3 6 0 4 调节pH至10 0 为流动相 流速1 0mL min AgilentZORBAXExtend C18 150mm 4 6mm 5 m 碱性色谱柱 柱温30 硫酸西索米星与硫酸奈替米星含量测定方法研究 福建省药检所采用HPLC ELSD对硫酸西索米星和硫酸奈替米星的含量测定方法进行了研究 建立了良好的色谱方法 图5 2 图5 3 并采用分段双对数转换线性方程 分别对硫酸西索米星和硫酸奈替米星的主成分以及有关物质进行了定量 取得了较好结果 硫酸西索米星与硫酸奈替米星含量测定方法研究 图5 2硫酸西索米星HPLC ELSD色谱图 硫酸西索米星与硫酸奈替米星含量测定方法研究 图5 3硫酸奈替米星HPLC ELSD色谱图 硫酸西索米星与硫酸奈替米星含量测定方法研究 色谱条件 以0 2mol L三氟醋酸 甲醇 90 10 为流动相 流速0 60mL min 检测器条件 Alltech2000 漂移管温度110 载气流速2 6L min 硫酸庆大霉素组分C组分含量测定方法 目前各国药典中 包括BP 1997版 对庆大霉素C组分的控制全部采用衍生化HPLC法 但该法中C1峰前后均有杂质峰干扰 使不同实验室测定结果间尤其是C1组分间存在较大差异 影响了药品质量控制的严肃性 硫酸庆大霉素组分C组分含量测定方法 采用HPLC ELSD法分析可以克服上述衍生化方法的不足 各组分之间能有效分离 且各组分在ELSD中的响应因子基本一致 使测定结果更准确 庆大霉素标准品及其供试品的HPLC ELSD色谱图分别见图5 4A 5 4B 硫酸庆大霉素组分C组分含量测定方法 图5 4庆大霉素标准品 A 及其样品 B 的HPLC ELSD色谱图1 硫酸盐 2 庆大霉素C1a 3 庆大霉素C2 4庆大霉素C2b 5 庆大霉素C2a 6 庆大霉素C1 7 未知杂质 硫酸庆大霉素组分C组分含量测定方法 色谱条件 以0 2mol L三氟醋酸 甲醇 94 6 为流动相 流速0 60mL min 检测器条件 Alltech2000 漂移管温度110 载气流速2 80L min 色谱柱 DiamonsilC18柱 150mm 4 6mm 5 m HPLC ELSD法分析小诺霉素及其有关物质 目前关于小诺霉素有关物质分析的报道还很少 文献报道中采用邻苯二甲醛柱前或柱后衍生 经荧光或紫外检测器检测 但该法中衍生化条件对测定结果影响较大 尤其是柱前衍生化 采用HPLC ELSD法分析则能有效地克服上述衍生化方法的不足 HPLC ELSD法无须衍生化 简化了样品的前处理 同时降低了试验操作误差 见图5 5 HPLC ELSD法分析小诺霉素及其有关物质 图5 5小诺霉素标准品 A 及其供试品 B 的HPLC ELSD色谱图1 硫酸根 2 庆大霉素C1a 3 小诺霉素 HPLC ELSD法分析小诺霉素及其有关物质 色谱条件 同硫酸庆大霉素组分C组分含量测定方法 以0 2mol L三氟醋酸 甲醇 94 6 为流动相 流速0 60mL min 检测器条件 Alltech2000 漂移管温度110 载气流速2 80L min 色谱柱 DiamonsilC18柱 150mm 4 6mm 5 m 某未知氨基糖甙类抗生素 N1 N2 组分分析 为分析两种未知氨基糖甙类抗生素物质的组成情况 采用HPLC ELSD发现N1中含有硫酸根 一个主组分和5个小组分 图5 6 而采用ELSD与UVD串联分析N2则 在ELSD中检出16个组分 UVD中仅检出11个组分 图5 7 显示了ELSD在分析未知化合物时的优势 某未知氨基糖甙类抗生素 N1 N2 组分分析 图5 6N1HPLC ELSD组分分析色谱图1 峰为硫酸 2 7 峰为杂质峰 8 峰为主成分 某未知氨基糖甙类抗生素 N1 N2 组分分析 N1色谱条件 AlltechA B泵 AlltechELSD2000 载气流速2 9L min 漂移管温度110 大连江申BDS C18 200 4 6mm 5 色谱柱 以0 2mol L三氟乙酸 乙腈 9 1 为流动相 流速0 6ml min 某未知氨基糖甙类抗生素 N1 N2 组分分析 图5 7N2HPLC ELSD UVD组分分析色谱图上部分1 16 峰为ELSD检测得到 下部分1 11 峰为UVD检测得到 某未知氨基糖甙类抗生素 N1 N2 组分分析 N2色谱条件 AlltechA B泵 AlltechELSD2000 WatersUV486 检测波长220nm ELSD载气流速2 9L min 漂移管温度110 大连江申BDS C18 200 4 6mm 5 色谱柱 以0 2mol L三氟乙酸 乙腈 6 1 为流动相 流速0 6ml min 2005版药典附录VD 2000版对仪器的一般要求 除另有规定外 检测器为紫外吸收检测器 2005版对仪器的一般要求 最常用的检测器为紫外检测器 其他常见的检测器有二极管阵列检测器 DAD 荧光检测器 示差折光检测器 蒸发光散射检测器 电化学检测器和质谱检测器等 2005版药典收载的抗生素品种 抗生素ELSD品种算法 外标法三点双对数直线回归方程计算 2005版药典收载的中药品种 中药ELSD品种算法 外标法两点对数方程计算 ELSD计算方案 三点随行二次曲线方程计算法 ELSD计算方案 由于ELSD响应信号和进样量的非线性对应关系 HPLC ELSD的定量计算应该采取适当措施以减小计算误差 根据我们的实验经验和研究结果 我们提出采用三点随行二次曲线方程计算法 能够兼顾工作效率和实际情况 取得较准确的测量结果 ELSD计算方案 三点随行二次曲线是指以待测样品为中心 采取高 中 低三个浓度的对照品随行实验 以三个浓度对照品进样量与峰面积进行二次曲线拟和 得到随行二次曲线方程 即 1 其中 为峰面积为进样量 当时 三点成一条直线 再将供试品峰面积代入 1 式 计算供试品进样量 由于均大于零 二次求解取正值所以 2 通过 2 式的计算结果可以得出供试品中的相对含量 ELSD计算方案 三点随行二次曲线是指以待测样品为中心 采取高 中 低三个浓度的对照品随行实验 以三个浓度对照品进样量与峰面积进行二次曲线拟和 得到随行二次曲线方程 即 1 其中 为峰面积为进样量 当时 三点成一条直线 再将供试品峰面积代入 1 式 计算供试品进样量 由于均大于零 二次求解取正值所以 2 通过 2 式的计算结果可以得出供试品中的相对含量 ELSD计算方案 希望通过此方案解决HPLC ELSD含量测定 组分分析和有关物质测定 为了便于方案的实施 减少人工操作 体现GLP精神 我们拟定与Alltech公司合作 将计算方案编制成计算程序 通过一定的认证和验证后 与Alltech工作站链接推广使用 ELSD计算方案 1 三点随行二次曲线方程采用三点随行二次曲线方程 是我们根据ELSD的响应特征和多种情况的综合考虑结果 首先 我们排除了采用一点对照法 即直接外标法 因为ELSD灵敏度有限 线性方程不过原点 采用外标法必然存在较大的计算偏差 ELSD计算方案 1 三点随行二次曲线方程其次 我们排除了采用两点对照法 两点法即在测定样品两侧 选择高低两个浓度的对照品进行校正计算 两点决定一条直线 该直线不过原点 两点法考虑了截距影响 较一点法有所改善 但是 由于ELSD响