无淀粉麦麸为底物体外植酸酶活性评价方法的建立.doc

植酸酶活性评价方法的建立摘要 为提高体外检测方法的科学性和客观性, 预测植酸酶在动物体内的活性和作用效果, 研究以无淀粉麦麸为底物, 探索并建立了一种更为客观评价植酸酶活性的检测方法。与现有的植酸酶酶活测定国家标准相比, 在不同pH 值的缓冲液中检验植酸酶降解天然植酸的效果, 具有更为科学、客观与简便等优点。关键词 植酸酶; 无淀粉麦麸Abstract In order to evaluate phytase activity more scientific and accurate, a new method was proposed by detectingphosphate releasing at different pH buffer using non- starch wheat bran as substrate.Compared with the present nationalstandard method, this new method is more scientific, accurate and convenient.Key words phytase; non- starch wheat bran植物性饲料中的植酸酶由于能够降解植酸并释放出其中的磷和所结合的氨基酸与微量元素而广泛应用于饲料添加剂 ( 陈文等, 2005; Spencer等, 2000)。随着植酸酶在饲料中的广泛应用, 对植酸酶活性评价方法的需求也越来越迫切 (陆文清等, 2004)。目前, 植酸酶的活性评价主要以植酸钠为底物, 这种方法存在以下几方面的缺点: 首先, 饲料成分相对复杂, 纯化的植酸钠不能模拟植酸酶在体内作用时所面对的复杂底物成分; 其次,植酸酶进入体内胃内的酸性环境, 目前方法所选择的 pH 5.5 并不能体现植酸酶在该阶段的作用效果。为了进一步提高体外检测方法的科学性与客观性, 本研究拟以植物性饲料无淀粉麦麸, 增加活性评价时的 pH 梯度和处理时间, 进而建立一种更为客观评价植酸酶体内活性的检测方法。1 材料与方法1.1 材料 待测植酸酶, 三水乙酸钠, 植酸钠, 浓盐酸, Tween20, 胃液, 无淀粉麦麸。1.2 仪器 全自动分光光度计, 水浴锅, 离心机,分析天平等。1.3 方法与步骤1.3.1 标 准 曲 线 的 制 备 参 见 国 家 标 准 GB/T18634- 2002。1.3.2 无淀粉麦麸的制备 称取 200 g 麦麸, 加入 2000 mL 浓度为 0.1 mol/L 的醋酸- 醋酸钠缓冲液(pH 6.0), 在 40 浸泡 6 h。用不锈钢筛网(20目孔径) 过滤, 取滤渣, 用蒸馏水浸泡、冲洗 3 次,充分清洗麦麸中的淀粉和可溶于水的小分子物质。在 80 气流干燥 6 h 至含水量不超过 8.0 %。1.3.3 酶缓冲溶液的制备 参见国家标准 GB/T186342002, 配置 pH 2.5 和 5.5 的 0.25 mmol/L醋酸- 醋酸钠缓冲液。1.3.4 植酸酶测定无淀粉麦麸中的含磷量 分别准确称取 2 g 无淀粉麦麸分别加入有 200 mL pH5.5 和 pH 2.5 缓冲酶液的三角瓶中, 摇匀, 于 37水浴锅中反应, 每 1 h 取样 1 次, 每次取 6 mL 再加入 4 mL 的钒- 钼酸铵比色液比色, 在此过程中, 随着反应时间的延长, 磷的释放量的增多, 会出现颜色过深, 当吸光度值超过 1, 则需加大酶液的稀释倍数, 再进行比色。根据比色的结果计算反应后液体中的含磷量, 最终以反应时间为横坐标,释放出来的磷为纵坐标, 分别绘制两个 pH 时, 在植酸酶的作用下磷释放量随反应时间的变化曲线。1.3.5 新鲜胃液的制取 从屠宰场取生长猪的新无淀粉麦麸为底物体外鲜的胃(2 3 个), 将猪胃割开, 用 4 6 层纱布将胃内容物过滤, 收集滤液。1.3.6 测定胃液中酶活损失 准确移取新鲜胃液500 mL 于反应瓶中, 向其中加入 2.5 g 待测植酸酶, 立即取出 25 mL 放于三角瓶中, 测定其酶活,将剩余的反应液置于 37 的水浴锅中反应, 每半小时取样 1 次, 得到胃液条件下植酸酶活性变化的曲线。2 结果与分析2.1 以无淀粉麦麸为底物评价植酸酶的活性2.1.1 无淀粉麦麸最适添加量的确定 为了确定无淀粉麦麸的最佳添加量, 试验中分别设定底物量为 0.5 %、1 %、1.5 %、2 %、2.5 %, 然后用不同添加量的底物进行植酸酶反应, 结果显示, 在浓度为 0.5 %时, 反应到 4 h 后就不再释放磷, 说明底物量不足; 而当底物浓度大于 1 %时, 在反应 7 h后用钒- 钼酸铵比色, 磷的浓度就过高; 只有当底物浓度为 1 %时, 能保证向底物中添加植酸酶后的 12 h 磷的释放量随反应时间逐步增加( 试验设定反应时间为最长 12 h)。由此可见底物浓度为1 %是最适宜的底物添加量。2.1.2 不同 pH 条件下磷的释放量随植酸酶处理变化规律的研究 见图 1。图 1 结果表明, 在两个 pH 下磷的释放量都逐渐增加, 此外 pH 2.5 比 pH 5.5 的条件下磷的释放量更多, 说明此酶在 pH 2.5 的条件下具有更高的活性。2.2 胃液条件下植酸酶活性的变化情况 见图2。由图 2 可以看出, 在新鲜胃液中, 随着反应时间的延长, 植酸酶活性有所下降, 但下降程度不是很大。3 讨论植酸酶酶活测定的国家标准 GB/T186342002 是以植酸钠为作用底物, 而在实际的动物生产中却是以植物性饲料作为植酸酶作用的底物,为了更好地评价植酸酶在动物体内的作用效果,本试验选择以无淀粉麦麸作为底物。同时, 考虑到动物胃液的 pH 一般为 2.5 左右, 无淀粉麦麸试验中, 植酸酶在动物胃液中起作用后, 会随着部分胃液进入肠道, 这时, 由于胃酸的影响, 肠道中 pH可能保持在 5.5 左右, 综合上述因素以及国家标准中 pH 5.5 的分析条件, 本研究选择了 pH 值 2.5和 5.5 作为植酸酶的评价条件。为了验证植酸酶通过胃内酸性环境后的活性情况, 本研究对胃液处理后植酸酶的活性情况进行了分析, 从本研究的结果来看, 酶活虽有一定程度的下降, 但总体看来, 植酸酶在通过胃内酸性环境后, 仍有 80 %以上的活性, 进一步确证了 pH5.5 条件下评价植酸酶活性的意义。此外, 本方法只需将稀释好的植酸酶加入到一定浓度的底物中, 在特定的时间点取样, 用钒-钼酸铵比色即可; 同时在 12 h 内连续取样, 能够更好的模拟动物采食后整个消化过程中的植酸磷释放的过程。参考文献1 陈文, 黄艳群, 陈代文, 等.植酸酶对长白荣昌杂交仔猪饲粮钙、磷利用率影响的研究J.四川农业大学学报, 2005, 4: 446 449.2 陆文清, 李德发, 邓萍, 等.黑曲霉固态发酵饲用复合酶酶活分析J.中国饲料, 2004, 3: 21 23.3 国家标准化管理委员会.GB/T 18643- 2002.饲用植酸酶活性的测定- 分光光度法S.北京: 中国标准出版社, 2004- 05- 01.4 Spencer J D, Allee G L, Sauber T E.Phosphorus bioavailability anddigestibility of normal and genetically modified low- phytate corn for pigsJ.JAnim Sci, 2000, 78: 675 681.通讯地址: 北京市海淀区圆明园西路 2 号农业部饲料工业中心, 邮编: 1000