游离氨基酸总量的测定.doc

_植物体内游离氨基酸总量的测定方法一：一、 原理游离氨基酸的氨基可与水合茚三酮反应，产生蓝紫色化合物，其颜色的深浅与游离氨基酸的含量成正比。二、仪器设备分光光度计；电子天平；容量瓶25ml或50ml 3个；漏斗（直径6厘米）3个、滤纸适量；20ml刻度试管 7支；移液管0.5ml 3支、5ml 1支；试管架；玻棒；吸耳球；剪刀；移液管架；橡皮筋、塑料薄膜（封试管口）；吸水纸；擦镜纸适量；电炉；水浴锅（含铁丝筐）。三、试剂1. 3%茚三酮试剂 称3g茚三酮用95%乙醇溶解定容到100ml容量瓶里，贮于棕色瓶中。此试剂应放在冷凉处，不宜久放，使用期约10天。2. 氰酸盐缓冲液（按以下方法配制）：（1）NaCN贮备液0.01mol/L（490mg/L）。（2）醋酸缓冲液：称360g醋酸钠（含三分子结晶水）溶于约300ml无氨蒸馏水中，加66.67ml冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至1L。取溶液（1）20ml，用溶液（2）定容到1L。3. 标准氨基酸 精确称取在80下烘干的亮氨酸13.1mg（或-丙氨酸8.9mg）溶于10%的异丙醇中，并在100ml容量瓶中用10%异丙醇稀释至刻度，混匀，即为1mmol/L的标准氨基酸贮备液，置冰箱中保存。为了制备工作液，可取贮备液与等量无氨蒸馏水混合，此液浓度为0.5mmol/L，即1ml含氨基酸0.5mol，或氨基氮7g。4. 95%乙醇；异丙醇（分析纯）。四、操作步骤1. 标准曲线的制作取20ml刻度试管18支，按下表1加入各试剂。加完试剂后混匀，在100水浴中加热12min（加热时封口），取出在冷水中迅速冷却，立即于每管中加入5ml 95%乙醇，塞好塞子，猛摇试管，使加热时形成的红色产物被空气中的氧所氧化而褪色，此时溶液呈蓝紫色。于570nm波长下测其光密度（以空白管为参比），以氨基酸浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出直线方程。2. 样品提取选取有代表性的植物叶片（或其它组织），洗净擦干，剪碎混匀，迅速称取0.100.20g（视氨基酸含量多少而定），共称3份，分别加入20ml刻度试管中，再加蒸馏水10ml盖塞（或系上塑料薄膜），置沸水浴中20min以提取游离氨基酸，到时取出在自来水中冷却，把上清液滤入25ml容量瓶中，之后再往试管中加5ml蒸馏水，置沸水浴上再加热10min，过滤并反复冲洗残渣，最后定容至刻度，摇匀。3. 样品测定另取4支洁净干燥的试管，其中3支分别加入0.5ml提取液，另一支加0.5ml蒸馏水，然后在上述4支试管中分别加入NaCN缓冲液、水合茚三酮各0.5ml，加完试剂后盖塞，置沸水浴上加热12min，冷却后，再分别加5ml 95%乙醇，摇匀，以空白作参比，在波长570nm下测其光密度。根据光密度查标准曲线（或用回归方程计算）即可求出提取液中氨基酸的浓度。方法二：一、原理游离氨基酸的氨基可与水合茚三酮反应，产生蓝紫色化合物，其颜色的深浅与游离氨基酸的含量成正比。二、仪器设备分光光度计；电子天平；容量瓶25ml或50ml 3个；漏斗（直径6厘米）3个、滤纸适量；20ml刻度试管 7支；移液管0.5ml 3支、5ml 1支；试管架；玻棒；吸耳球；剪刀；移液管架；橡皮筋、塑料薄膜（封试管口）；吸水纸；擦镜纸适量；电炉；水浴锅（含铁丝筐）。三、试剂1. 3%茚三酮试剂 称3g茚三酮用95%乙醇溶解定容到100ml容量瓶里，贮于棕色瓶中。此试剂应放在冷凉处，不宜久放，使用期约10天。2. 氰酸盐缓冲液（按以下方法配制）：（1）NaCN贮备液0.01mol/L（490mg/L）。（2）醋酸缓冲液：称360g醋酸钠（含三分子结晶水）溶于约300ml无氨蒸馏水中，加66.67ml冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至1L。取溶液（1）20ml，用溶液（2）定容到1L。3. 标准氨基酸精确称取在80下烘干的亮氨酸13.1mg（或-丙氨酸8.9mg）溶于10%的异丙醇中，并在100ml容量瓶中用10%异丙醇稀释至刻度，混匀，即为1mmol/L的标准氨基酸贮备液，置冰箱中保存。为了制备工作液，可取贮备液与等量无氨蒸馏水混合，此液浓度为0.5mmol/L，即1ml含氨基酸0.5mol，或氨基氮7g。4. 95%乙醇；异丙醇（分析纯）。四、操作步骤1. 标准曲线的制作 取20ml刻度试管18支，按下表1加入各试剂。加完试剂后混匀，在100水浴中加热12min（加热时封口），取出在冷水中迅速冷却，立即于每管中加入5ml 95%乙醇，塞好塞子，猛摇试管，使加热时形成的红色产物被空气中的氧所氧化而褪色，此时溶液呈蓝紫色。于570nm波长下测其光密度（以空白管为参比），以氨基酸浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出直线方程。表1 各试管加入试剂量2. 样品提取 选取有代表性的植物叶片（或其它组织），洗净擦干，剪碎混匀，迅速称取0.100.20g（视氨基酸含量多少而定），共称3份，分别加入20ml刻度试管中，再加蒸馏水10ml盖塞（或系上塑料薄膜），置沸水浴中20min以提取游离氨基酸，到时取出在自来水中冷却，把上清液滤入25ml容量瓶中，之后再往试管中加5ml蒸馏水，置沸水浴上再加热10min，过滤并反复冲洗残渣，最后定容至刻度，摇匀。3. 样品测定 另取4支洁净干燥的试管，其中3支分别加入0.5ml提取液，另一支加0.5ml蒸馏水，然后在上述4支试管中分别加入NaCN缓冲液、水合茚三酮各0.5ml，加完试剂后盖塞，置沸水浴上加热12min，冷却后，再分别加5ml 95%乙醇，摇匀，以空白作参比，在波长570nm下测其光密度。根据光密度查标准曲线（或用回归方程计算）即可求出提取液中氨基酸的浓度。4. 计算游离氨基酸含量式中 C：由