1 蛋白质的结构与功能.ppt

Chapter1 蛋白质的结构与功能 西北农林科技大学生命科学学院张林生 Structureandfunctionofprotein 蛋白质是活细胞中含量最丰富 功能最复杂的生物大分子 是各种生物功能主要的体现者 以核酸 蛋白质的结构 功能及其相互关系为中心 逐渐形成了分子生物学 成为带领生命科学进入新时代的龙头 蛋白质的功能与其特殊的结构有着十分密切的内在联系 结构是特定功能的内在依据 功能则是特定结构的外在表现 因此 阐明蛋白质的分子结构及其与功能的关系是现代生物化学的基本命题 是揭示生命运动规律的必由之路 每一种蛋白质至少都有一种构象在生理条件下是稳定的 并具有生物活性 这种构象称为蛋白质的天然构象 蛋白质的天然折叠决定于3个因素1 蛋白质的氨基酸序列2 与溶剂分子 一般是水 的相互作用3 溶剂的pH和离子组成 1 1蛋白质分子的结构 一级结构 primarystructure 指多肽链中氨基酸残基的数目 组成及其排列顺序 N 端 C 端 即由共价键维系的多肽链的二维 线性 结构 不涉及空间排列 牛胰岛素的一级结构 二级结构 secondarystructure 是多肽链主链 backbone 在氢键等次级键作用下折叠成的构象单元或局部空间结构 未考虑侧链的构象和整个肽链的空间排布 三级结构 tertiarystructure 则指整个肽链的氨基酸残基侧链基团互相作用以及与环境间的相互作用下形成的三维结构 寡聚体内亚基的空间排列称为四级结构 quaternarystructure 有关四级结构的一些概念蛋白质的四级结构球状蛋白质通过非共价键彼此缔合在一起 形成的聚集体 就是蛋白质的四级结构 亚基或单体四级结构的蛋白质中每个球状蛋白质称为亚基 有时也称单体 monomer 亚基一般是一条多肽链 寡聚蛋白质由两个或两个以上亚基组成的蛋白质统称为寡聚蛋白质 很多酶和转运蛋白质是寡聚蛋白质 单体蛋白质仅由一个亚基组成并因此无四级结构的蛋白质称为单体蛋白质 如核糖核酸酶等 同多聚蛋白质由单一类型亚基组成的蛋白质称同多聚 homomultimeric 蛋白质 如肝乙醇脱氢酶 2 超二级结构 相邻的二级结构往往形成某种有规律的 空间上可辩认的 更高层次的折叠单元 称为超二级结构 super secondarystructure 或折叠单元 foldingunit 主要涉及这些构象元件在空间上如何聚集 与此同时 Wetlaufer观察到蛋白质分子中存在相对稳定的球状亚结构 其间由单肽链相互连接 命名为结构域 structuraldomain 以树状表示了蛋白质的结构层次 主要的蛋白质序列和结构数据库 1 1 1蛋白质的一级结构 1 1 1 1蛋白质氨基酸 表1 1蛋白质氨基酸的某些特性 表1 1蛋白质氨基酸的某些特性 46种蛋白质共5436个残基中各种氨基酸残基所占百分比为总频率 在分子内部每种残基总数被内部残基总数 1396 除所得百分比为在内部的频率 在分子表面每种残基总数除以表面残基总数 4040 得到的百分比为在表面的频率 1 1 2 2肽键的性质 肽键具有部分双键的性质 肽键两端有关原子 羰基C 羰基O 羰基C连接的C 氨基N 氨基H和氨基N连接的C 必须处于同一平面 称为肽平面 绕C C 单键转动的为 角 绕N C 单键转动的为 角 相邻的肽平面通过C 彼此连接 图1 5 角以C C对N H键呈反式时为0 角以N C 对C O键呈反式时为0 从C 看 C C键或N C 键顺时针方向旋转用 号表示 沿反时针方向旋转用 号表示 肽链主链上只有C 连接的两个键 C N C C 是单键 它们可以旋转 绕 C N 键旋转的角度称 角 绕 C C 键旋转的角度称 角 这两个旋转角度称二面角 dihedralangle 可表示出相邻的肽平面的相对位置 180 180 肽平面与二面角 1 1 1 2蛋白质一级结构研究进展 蛋白质的一级结构是指蛋白质中氨基酸的排列顺序 1953年英国Sanger等人 完成了牛胰岛素 Insulin 一级结构测定工作 分子量为5700D 有A链 21Aa 和B链 30Aa 两条肽链 两个链间有二硫键和一个链内二硫键 A链 氨基酸组分分析 Sanger反应测定N 端氨基酸 Edman反应测定氨基酸序列 1 Edman降解试剂和方法的改进 2 序列仪的改进与创新 3 质谱法在蛋白质测序中的应用 4 核酸测序与蛋白质测序有机结合 相互印证 仍是当前的最佳选择 1 1 2蛋白质的二级结构 1 1 2 1决定蛋白质高级结构的因素 1 肽链的折叠模式取决于其特定的氨基酸序列多肽链中氨基酸序列包含着决定其三维结构的信息 称为蛋白质卷曲密码 codeofproteinfolding 或立体化学密码 stereochemistrycode 至今尚未完全破译 2 细胞内特有的微环境 pH 离子强度 水 温度等 是多肽链折叠成天然构象的重要环境因素 3 维持蛋白质三维结构的作用力 表1 2蛋白质中的二硫键和几种次级键的键能 a键能指断裂该键所需的自由能 b此数值表示25下非极性侧链从蛋白质内部转移到水介质中所需的自由 1 1 2 3蛋白质的二级结构 1 螺旋 helix 螺旋 3 613R 310R螺旋 螺旋 4 416R 2 片层 pleatedsheet 3 回折 reverseturn 回折 回折 在多肽链中 经常见到约180 反折结构 这样的结构称为转角 或回折 转角也存在于小肽中 虽然不是必需的 它常被位于C端的氨基和N端的羧基间的氢键所稳定 按照转角所涉及的氨基酸数目 分为 转角 转角 转角或 转角 其中 转角比较常见 转角的结构特征为 通常由4个氨基酸残基组成 转角结构中第1个氨基酸残基的羰基氧原子与第4个残基的亚氨基氢原子之间形成1个氢键 主链骨架以180 返回折叠 C1与C4之间的距离小于0 7nm 环简称环 最近十几年才提出的一类二级结构 早年认为在蛋白质的某些肽段是已无归卷曲的构象形式出现的 然而进一步研究发现其中有相当的部分虽然不像 螺旋和 折叠那样规则 但仍有一定的规律可循 故认为是有序或准有序的结构 因为这类肽段的外形和希腊字母 相似 故称为 环 从形式上看 环可以看成是转角的延伸 环的特征为 由不超过10个氨基酸残基组成的肽段 尤其以8个残基的小环最多 环改变了肽链的走向 构成 环的首尾两个氨基酸残基之间的距离小于10A 一般介于0 37 1 0nm之间 多数是0 5 0 7nm 最常见的距是0 5 5 5nm 环的可变性比转角更大 也很难分类 4 环 loop 5 连接条带 6 无序结构 无序结构是指长度和走向没有确定规律性的区域 可能由于其能不断地运动 或该区域具有不同构象的缘故 但该区域在肽链折叠中也不是完全任意的 有些肽链的无序结构在结合配体时可转变为有序结构 螺旋的各种图示 螺旋中氨基酸侧链R分布在螺旋外侧 其形状 大小及电荷影响 螺旋的形成 酸性或碱性氨基酸集中的区域 由于同电荷相斥 不利于 螺旋形成 较大的R 如苯丙氨酸 色氨酸 异亮氨酸 集中的区域 也妨碍 螺旋形成 脯氨酸因其 碳原子位于五元环上 不易扭转 加之它是亚氨基酸 不易形成氢键 故不易形成上述 螺旋 甘氨酸的R基为H 空间占位很小 也会影响该处螺旋的稳定 片层示意图 根据第二和第三肽单位的两面角不同 转角又可分为 型和 型两种类型 型 转角中间肽单位的羰基与其相邻的2个R侧链呈反向排布 型 转角中间肽单位的羰基与其相邻的2个R侧链呈同向排布 型 转角较不稳定 一般只有当第三个残基是甘氨酸残基时才存在 故又称为甘氨酸转角 两种 turn 型 回折 型 回折 9 14 环 Ramachandran根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离 确定了哪些成对二面角 所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的 哪些是不允许的 并且以 为横坐标 以 为纵坐标 在坐标图上标出 该坐标图称拉氏构象图 拉氏构象图 由于原子基团之间不利的空间相互作用 肽链构象的范围是很有限的 可允许的 和 值 Ramachandran构象图 实线封闭区域一般允许区 非键合原子间的距离大于一般允许距离 此区域内任何二面角确定的构象都是允许的 且构象稳定 虚线封闭区域是最大允许区 非键合原子间的距离介于最小允许距离和一般允许距离之间 立体化学允许 但构象不够稳定 虚线外区域是不允许区 该区域内任何二面角确定的肽链构象 都是不允许的 此构象中非键合原子间距离小于最小允许距离 斥力大 构象极不稳定 对非Gly氨基酸残基 一般允许区占全平面的7 7 最大允许区占全平面20 3 右扭曲 丙酮酸激酶 各种二级结构元件的二面角 二级结构的可变性 超二级结构supersecondarystructure 也称为元件or标准折叠单元or折叠花式若干相邻的二级结构元件 主要是 螺旋和 折叠 以及它们之间的联接片段组合在一起 彼此相互作用 形成种类不多的 有规则的二级结构组合或二级结构串 在多种蛋白质中充当三级结构的构件 称为超二级结构 1 1 3超二级结构 1 1 3 1简单超二级结构 1 拐角 corner 2 发夹 hairpin 3 发夹 hairpin 4 拱形结构 arch 简单超二级结构 1 复绕 螺旋 coiled coil helix 1 1 3 2复杂的超二级结构 2 单元 unit 3 迂回 meander 4 折叠筒 sheetbarrel 1 1 3 3一些已知功能的超二级结构 1 螺旋 回折 螺旋 helix turn helix HTH 1983发现于 噬菌体cro阻遏蛋白 由两个 螺旋通过一个 回折连接而成 含有66个氨基酸残基 HTH羧基端螺旋可嵌入DNA双螺旋主槽中 螺旋暴露的氨基酸侧链基团与主槽中暴露的碱基之间形成专一的氢键 2 锌指 Zinefenger ZF 状凸出 锌指蛋白 包括锌指 锌钮和锌簇结构 有锌参与时才具备转录调控活性 与DNA的结合较为牢固 特异性也很高 类固醇激素受体家族含有连续的两个锌指结构 以同源或异源性二聚体的方式将两个 螺旋结合在相邻的两个大沟中 图1 17锌指结构模体A一个锌指结构的氨基酸序列示意图 B小鼠转录因子含有3个锌指结构 识别特定的碱基序列 图中黑色小球代表Zn2 在不同蛋白中ZF模体含14 48个氨基酸不等 通常约含有30个残基 其线性序列可概括为 Xn C H X2 4 C H X4 20 C H X2 4 C H Xn Zn2 与其中的两个半胱氨酸 C 和两个His H 残基的四个配位原子以四面体方式配位 中间的X4 20形成指状凸出 锌指蛋白与DNA相互作用时 锌指部分嵌入主槽 识别特定的碱基序列 每个锌指大约识别5个碱基对 3 亮氨酸拉链 LeucineZipper LZ 1988年 在细胞色素c基因调节蛋白 原癌基因myc v jun v fos的产物和CCAATbox结合蛋白中发现了Leu拉链结构 亮氨酸拉链 leucinezipper 是由伸展的氨基酸组成 每7个氨基酸中的第7个氨基酸是Leu Leu是疏水性氨基酸 排列在 螺旋的一侧 所有带电荷的氨基酸残基排在另一侧 当2个蛋白质分子平行排列时 Leu之间相互作用形成二聚体 形成 拉链 在 拉链 式的蛋白质分子中 Leu以外带电荷的氨基酸形式同DNA结合 LZ结构的C 端为螺旋区 靠近N 端一侧的一段螺旋富含碱性残基 其后的一段螺旋每隔7个残基就有1个Leu 每个这样的螺旋不少于4个Leu 且都处于螺旋同一侧 这样 当含LZ的蛋白形成同源或异源二聚体时 LZ结构中的Leu残基借助于疏水作用彼此靠拢 形同拉链 4 螺旋 环 螺旋 helix loop helix HLH 1991年发现的 由3个部分组成 螺旋1约含12个疏水残基 中间是约60个残基组成的几个 回折构成的环 螺旋2约含15个疏水残基 HLH以同源或异源二聚体形式与DNA相互作用 已报道的数十种含HLH的蛋白质几乎都与转录调控和肿瘤发生有关 包括增强子结合蛋白 EBP 和原癌基因c myc myd D等的产物 5 EF手 EF hand Kretsinger在小清蛋白中首先发现了EF手结构 由两个 螺旋 E和F 与连接它们的环组成 E螺旋含9个残基 用右手食指表示 与Ca2 结合的环含12个残基 用弯曲的中指表示 F螺旋含有18个残基 用拇指表示 1 1 4结构域 1 1 4 1结构域的概念 球蛋白分子内存在紧密的球状亚结构 称为结构域 结构域的概念具有三种不同而又相互联系的涵义 即独立的结构单位 独立的功能单位和独立的折叠单位 多肽由几百个氨基酸组成 经常折叠成两个或更多的稳定系统 球状单元 在许多情况下 由大蛋白组成的结构域保持其正确的三维结构 甚至分成一些片断 肽片断 结构域有时也指功能域 functiondomain 功能域是蛋白质分子中能独立存在的功能单位 功能域可以是一个结构域 也可以是由两个或两个以上结构域组成 结构域的概念含有三个方面的涵义 独立的结构单位 独立的功能单位 独立的折叠单位 ThecellsurfaceproteinCD4consistsoffoursimilardomains 甘油醛3 磷酸脱氢酶的一个亚基含有两个不同的结构域 底物结合域 绿色 和NAD结合域 红色 腺嘌呤 烟碱 核糖 焦磷酸盐 结构域本身都是紧密装配的 结构域之间通过松散的肽链形成牢固而又柔韧的连接 为域间较大幅度的相对运动提供了可能 这种结构调整与其整体功能的行使密切相关 对马肝乳酸脱氢酶 LDH 的X 射线衍射结构分析表明 去辅基LDH与NAD 结合后发生显著的构象变化 域间相对运动使之从去辅基LDH的封闭形式转换为LDH全酶的开放形式 有利于底物进入活性部位 1 1 4 2结构域的运动 1 1 4 3结构域的分类 1 螺旋域 所含构象元件主要是 螺旋 例如蚯蚓血红蛋白 图1 23A 2 折叠域 主要由 折叠股构成 例如lgGVL结构域 图1 23B 3 域 由 螺旋与 折叠股不规则堆积而成 如3 磷酸甘油醛脱氢酶结构域2 图1 23C 4 域 中央为 折叠片 周围是 螺旋 螺旋与 折叠股交替排布 如丙酮酸激酶结构域1和磷酸甘油酸激酶结构域2 图1 23D E 5 无 螺旋和 折叠股域 没有或只有少量 螺旋和 折叠股 如麦胚凝集素就没有 螺旋 只有12 的残基形成 折叠股 图1 23F 结构域的分类 图1 23五种不同类型的结构域 1 1 4 3结构域的组合 在较复杂的蛋白分子中 结构域的组合主要有以下三种类型 1 由序列和结构相似的结构域组合而成 编码这类蛋白质的基因可能是同一始祖基因在分子进化中复制后串联而成 2 由两种不同的结构域组合面成 这类蛋白质的结构基因可能是两个不同的始祖基因在分子进化中融合的产物 3 多结构域蛋白由两种以上多个结构域镶嵌而成 图1 24出示几种多结构域镶嵌蛋白 这类蛋白质的结构基因可视为不同基因外显子重新组合的结果 1 1 5球形蛋白质的三级结构 多肽链在手性效应的驱动下 遵循尽量减小表面的原则 折叠 卷曲形成二级结构 超二级结构和结构域等局部三维结构 为了获得整体上能量最低的天然构象 这些局部三维结构还需进一步调整 形成三级结构 三级结构反映了蛋白质分子或亚基内所有原子的空间排布 但不涉及亚基间或分子间的空间排列关系 1 1 5 1球状蛋白质三维结构的特征 1 球状蛋白质分子含有多种二级结构元件 2 球状蛋白质三维结构具有明显的折叠层次 3 球状蛋白质分子是紧密的球状或椭球状实体 4 球状蛋白质具有疏水的内核和亲水的表面 球蛋白 螺旋部分被埋藏的在一般条件下 螺旋的一侧在水溶液中 疏水部分向着蛋白质的内部 asurfacehelixisthatofresidues153to166offlavodoxinfromAnabaena 黄素氧化还原蛋白 5 球状蛋白质分子表面有一空穴 乳铁传递蛋白 1 1 5 2球状蛋白质的分类 1 全 结构 反平行 螺旋 蛋白质 2 结构 平行或混合型 折叠股 蛋白 B A 质 磷酸丙糖异构酶 3 全 结构 反平行 折叠片 蛋白质 绿色荧光蛋白 4 富含金属或二硫键 小的不规则 蛋白质 图1 28富含二硫键蛋白质 A 和富含金属蛋白质 B 的实例 许多小于100氨基酸残基的小蛋白质或结构域往往不规则 只有很少量的二级结构 但富含金属或二硫键 金属形成的配体或二硫键对蛋白质构象起稳定作用 1 1 6球状蛋白质的四级结构 四级结构的形式具有以下优越性 1 四级结构赋予蛋白质更加复杂的结构 以便执行更为复杂的功能 2 通过亚基间的协同效应 可以对酶活性进行别构调节 3 中间代谢途径中有关的酶分子以亚基的形式组装成结构化多酶复合物 可避免中间产物的浪费 提高了催化效率 4 寡聚体的形成在一定程度上降低了细胞内渗透压 5 节约误差造成的浪费 遗传信息 减少生物合成中的除了少数情况 寡聚蛋白分子中的亚基在空间上呈对称排布 主要的排布方式见图1 29 6 可将大小 种类有限的亚基组装成具有特殊几何形状的超分子复合物 图1 29亚基排布方式A烟草花叶病毒的外壳蛋白亚基绕中心轴成螺旋状排列 BC2对称的二聚体 每个亚基绕中心轴旋转180 可与另一亚基重合 CC3对称的三聚体 每个亚基绕中心轴旋转120 可与另一亚基重合 D四聚体 E六聚体 F八聚体 烟草花叶病毒外壳蛋白结构 烟草花叶病毒外壳蛋白结构 由蛋白质和其它生物大分子以及某些小分子和金属离子组成的生物超分子体系大体上分为 离散型 膜结合型和紧密的非共价组合型 在功能上表现出超过其组分单独存在时各自的功能 呈现出分子机器的特征 生物超分子体系不仅是一个重要的结构层次 而且在一系列重大的望命运动中扮演关键性角色 1 1 7生物超分子体系 1 1 8纤维状蛋白质的结构 1 1 8 1 角蛋白 1 1 8 1 角蛋白 Keratin 角蛋白 硬 角蛋白强 软 角蛋白弱 皮肤与皮肤的衍生物 主要由 螺旋构象的多肽链组成 除了上述的 角蛋白充分伸展后可逆地转变为 角蛋白 构象 之外 自然界中还存在天然的 角蛋白 例如丝心蛋白 构成蚕丝或蜘蛛丝的一种蛋白质 片层结构 由反平行 折叠以平行的方式堆积成多层结构 链间主要靠氢键连接 层间主要靠范德华力维系 1 1 8 2丝心蛋白 Fibroin 主要是由具有小侧链的Gly Ala orSer 每隔一个残基就是Gly 角蛋白 在 sheet的上下两面上 一面是Gly 另一面是Ala Ser 片层的堆积也是Gly面对Gly面 Ala Ser 面对Ala Ser 面 丝蛋白的结构 由于这种结构方式使得蚕丝所承担的张力并不直接放在多肽链的共价键上 因此使丝纤维具有很高的抗张强度 1 1 8 3胶原蛋白 collagen 组织分布与类型属结构蛋白质使骨 腱 软骨和皮肤具有机械强度 图1 32胶原蛋白结构示意图 氨基酸组成皮肤中胶原蛋白肽链的96 是按三联体 G1y x y n顺序重复排列Gly数目占残基总数1 3X常为Pro y常为Hy Pro Hy Lys需Vc 是糖蛋白 由于Pro和Hyp的侧链是环形的 角固定在 60 左右 高含量的这些氨基酸促进左手螺旋的形成 在三股螺旋中 肽链每隔两个残基即第三个残基面向或位于拥挤的中心轴处 唯一能适合此位置的残基是Gly 其两端的残基位于螺旋的外侧 三股螺旋是一种错位的堆积结构 来自三股链的Gly残基沿三股螺旋的中心轴堆积 一股链上的Gly与第二股的x残基和第三股的y残基相邻 这样允许每个Gly残基的N H与相邻链的x残基的C O形成氢键 另外Hyp残基的羟基也参与链间氢键的形成 三股螺旋结构得到进一步的稳定和增强 Gly 原胶原蛋白的交错排列 在胶原蛋白的空隙中糖分子与5 hydroxylysine残基共价结合 原胶原分子内的共价交联 原胶原蛋白之间的交联发生在相邻的N端和C端之间 有1个Lys和2个羟基Lys缩合成一个吡啶啉结构 胶原蛋白的正面分子 由 肽组成至少有 l I l II l III 1 IV 和 2胶原蛋白I 1 I 2 2三螺旋 五种肽链AA顺序不同 分子量介于95000到100000之间 含1000个残基左右 胶原蛋白的类型 基底膜蛋白多糖 基板糖蛋白 内动蛋白及其他糖蛋 肌肉 肌纤维束 肌纤维 肌原纤维 肌球蛋白和原肌球蛋白 粗丝和细丝 轻酶解肌球蛋白 重酶解肌球蛋白 头片 木瓜蛋白酶 1 1 9无序蛋白 完全没有或仅有很少规正二级结构元件的天然蛋白 整体呈伸展而灵活的无序状态 称天然无序蛋白 intrinsicallydisoreredprotein 天然无结构蛋白 intrinsicallyunstructuredprotein 或天生的变性 去折叠蛋白 naturalydenatural unfoldingprotein 无序蛋白含较多的极性氨基酸残基 其舒展而柔韧的结构适宜于结合多种蛋白质 调节它们的活性与功能 因此涉及细胞周期调控 细胞信号转导 转录和翻译的调控以及多组分蛋白复合物的组装 由蛋白质和其它生物大分子以及某些小分子和金属离子组成的生物超分子体系大体上分为 离散型 膜结合型和紧密的非共价组合型 在功能上表现出超过其组分单独存在时各自的功能 呈现出分子机器的特征 生物超分子体系不仅是一个重要的结构层次 而且在一系列重大的望命运动中扮演关键性角色 1 1 10生物超分子体系 蛋白质分子结构与功能的联系 1 2蛋白质分子结构与功能的联系 了解蛋白质的三维结构是理解蛋白质如何行使其功能的基础 蛋白质功能总是跟蛋白质与其它分子相互作用相联系 被蛋白质可逆结合的其它分子称为配体 蛋白质 配体相互作用的瞬时性质对生命至关重要 因为它允许生物体在内 外环境变化时 能迅速 可逆地作出反应 蛋白质的结构与功能涉及蛋白质的生物学意义 蛋白质作用的分子机制以及蛋白质的亚细胞定位 肌红蛋白的三级结构辅基血红素O2与肌红蛋白的结合O2的结合改变肌红蛋白的构象肌红蛋白结合氧的定量分析 氧结合曲线 1 2 1肌红蛋白的结构与功能 1 2 1 1肌红蛋白的分子结构 血红素结构 肌红蛋白与氧的结合主要通过其中的血红素辅基结合 其中央的Fe II 形成6个配位键 可以与氧结合 卟啉环也可以与Cu I 结合最终形成血蓝蛋白 O2与肌红蛋白的结合 氧合改变MB的构象 0 026nm的位移 去氧肌红蛋白中由于His93的拉动 Fe II 移出卟啉环平面 O2的结合将Fe拉回原位 组氨酸F8和F7与HEM形成配位键 组氨酸O2和HisF8与血红素形成配位键 1 2 1 2肌红蛋白的功能 氧合肌红蛋白 咪唑 亚铁血红素 1 2 2血红蛋白的结构与功能 1 2 2 1血红蛋白分子结构 血红蛋白是由 2 2组成的四聚体 每个亚基都有一个血红素辅基 和一个氧结合部位 每一个亚基相当于一个肌红蛋白 血红蛋白的结构 四聚体 血红蛋白的四个亚基之间通过次级键结合在一起 其中不同的亚基之间的结合紧密 在血红蛋白和氧结合的过程中 亚基之间的缔合会受到影响 血红蛋白可看成是 二聚体的二聚体每个 二聚体作为一个刚体移动 有9个位置的残基是所有研究过的血红蛋白所共有的 这些高度保守的残基对血红蛋白分子的功能有着特殊重要的意义近侧组氨酸F8远侧组氨酸E7PheCD1和LeuF4与血红素接触 TyrHC2通过在H和F螺旋之间形成一个链内氢键以稳定分子GlyB6也是一个保守残基 这可能由于它的体积小 因为大于氢原子的侧链将不允许B和E螺旋彼此接近得如此紧密ProC2也很重要 因为它能引起C螺旋的终止 因而规定了C螺旋的一端 血红蛋白亚基之间可通过离子键相互作用 从而稳定其四级结构 在与氧结合的过程中 亚基间的离子键发生变化 BPG 2 3 二磷酸甘油酸2 3 bisphosphoglycerate Erythrocytes红细胞 redbloodcells normallycontainabout4 5mMBPG aconcentrationequivalenttothatoftetrameric四聚体hemoglobinmolecules PBG降低血红蛋白对氧的亲和力 BPG的结合 BPG的结合 BPG的结合 PBG和血红蛋白的结合位点远离氧结合位点 胎儿通过脐带从母体中获得氧 所以胎儿的血红蛋白和氧的亲和力必须大于成年人 a2r2 r亚基和PBG结合力下降 PBG表面的负电荷和分子表面的正电荷相互作用 R态 PBG不能和HB结合 当血红素氧合时分子的这两个 二聚体半分子彼此滑移 如果一个 二聚体固定不动 则另一个 二聚体将绕一个设想的通过两个 二聚体的偏心轴旋转15 并平移0 08nm此时在两个 二聚体之间的界面上某些原子将移动多至0 6nm 1 2 2 2血红蛋白的变构效应 肌红蛋白和血红蛋白的氧饱和曲线的比较血红蛋白对氧的结合具有分子开关效应 血红蛋白中各亚基之间存在协同效应 Hb的协同性氧合 然而实际观测到的氧结合曲线并不符合n 4的曲线 而是n 2 8 H 和CO2降低血红蛋白对O2的亲和力 pH的降低使S曲线右移 即氧合能力降低 促使O2解离 组织呼吸释放CO2 CO2进入红细胞H2O CO2 H2CO2 H HCOH促使HbO2解离 因而有利于从肺向组织运送O2H和CO2结合于Hb从组织运送到肺部 HCO2从血浆运送至肺肺部的高氧分压使O2与Hb结合 促使H和CO2解离 H 与HCO2结合H2CO2 然后分解为H2O和CO2经肺排出 H 是Hb氧合的别构抑制剂 Almost500geneticvariantsofhemoglobinareknowntooccurinthehumanpopulation allbutafewarequiterare 血红蛋白病 hemoglobinopathy 是由于 或 链发生了变化 镰刀状红细胞贫血症地中海贫血 thalassemia 是由于缺少了 或 链 1 2 2 3异常血红蛋白 镰刀形红细胞贫血症 1 分子表面发生变异的Hb HbA H2N Val His Leu Thr Pro Glu Glu LysCOOHHbS H2N Val His Leu Thr Pro Val Glu LysCOOHHbS 亚基的变化 Theaminoacidresiduesatposition6lieatthesurfaceofthehemoglobinmolecule错义突变 例如镰形细胞贫血是 基因第6位密码子GAG变成GTG 所致 InHbA Glu的R侧链是带负电荷的离子 而HbS的Val侧链是非极性的疏水基团 此变化降低了去氧蛋白的溶解度 Val侧链形成一个突起 与另一个HbS上的互补口袋通过疏水作用聚集沉淀 中国人较常见的HbE是 基因第26位密码子由GAG 谷 AAG 赖 2 血红素结合部位发生变异的Hb 图1 51HbM的氨基酸取代 HbM是因肽链中与血红素铁原子连接的His或邻近的氨基酸发生了替代 导致部分铁原子呈稳定的高铁状态 从而影响了正常的带氧功能 使组织供氧不足 导致临床上出现紫绀和继发性红细胞增多 本病呈常染色体显性遗传 杂合子HbM含量一般在30 以内 可引起紫绀症状 目前发现 有7种珠蛋白突变可以导致高铁血红蛋白血症 HbM 其中6种涉及His残基被Tyr所取代 Tyr侧链上的羟基能与二价铁离子形成稳定的配位键 形成三价铁的高铁Hb 氧亲和力下降 失去携氧功能 产生紫绀 一种是 链67位Val被Glu取代 Glu的游离羧基可与血红素二价铁离子结合 成为三价铁稳定状态 产生高铁Hb 这是由于Hb对氧亲合力升高 使氧离曲线左移 不易释放出氧 造成组织缺氧 缺氧刺激红细胞生成增加 导致代偿性的红细胞增多症 能引起Hb对氧亲合力升高的珠蛋白基因突变有50余种 但常见的 位于 1 2 或 2 1 亚基接触面的氨基残基发生了取代 珠蛋白肽链羧基端和2 3 DPG结合位点发生了氨基酸取代 血红素口袋四周的氨基酸被取代 这三种基因突变都导致Hb构象变化和对氧亲合力升高 氧离曲线左移 3 三级结构突变的Hb 4 四级结构突变的Hb 1 蛋白质折叠问题是当今结构生物学的 瓶颈性 难题 就像20世纪初物理学中的 黑体辐射 和 光电效应 一样 折叠问题被称为21世纪初生物学的 一朵乌云 该问题包含2个方面的研究 折叠热力学 foldingmechanics 和折叠动力学 foldingdynamics 和折叠模式的识别 recognitionoffoldingpatterns 前者是探究折叠发生的动态过程和途径 后者是分辨折叠的结果 以及氨基酸序列对折叠结构的决定性 蛋白质折叠的热力学 折叠结构在生理条件下是自由能最低的构象 因此多肽链的折叠是自发过程 蛋白质折叠归根结底取决于在某温度 T 下折叠态 F 和伸展态 U 之间的吉布斯 Gibbs 自由能差 G 在伸展态中多肽主链及其侧链是与溶剂水 也称介质水或环境水 相互作用的 因此折叠时自由能变化 G 的任何测量必须考虑多肽链和溶剂两者对焓变化 H 和熵变化 S 的贡献 对于典型的蛋白质来说 对折叠结构的稳定性作出单项最大贡献的是疏水残基引起的 S溶剂 对于典型的蛋白质来说 对折叠结构的稳定性作出单项最大贡献的是疏水残基引起的 S溶剂 水溶液 蛋白质折叠的动力学 Levinthal s疑题LevinthalC in1968提出该问题100个氨基酸残基的蛋白质每个氨基酸残基有3个不同取向每搜索一种可能的构象的时间10 13S总的搜索时间是3100 10 13 1 6 1027年 对于一个典型的蛋白质来说 它不可能有那么长的时间对所有可能的结构都搜索一遍 人们用累积选择理论在解释蛋白质折叠动力学问题 所谓累积选择就是在每次搜索时把正确的那部分结构保留下来 因此蛋白质折叠的实质就是保留局部正确折叠的中间体 蛋白质折叠是蛋白质由高能态向低能态过渡的过程 螺旋形式和折叠的开始状态 熔球态 折叠的中间体 1 3 1 2蛋白质卷曲途径 邹承鲁提出 新生肽链在翻译尚在进行中即开始卷曲 随着肽链的延伸不断调整其空间构象 直至合成结束后达到天然构象 其中既有伴翻译 co translational 又有翻译后 past translational 过程 卷曲过程在伸展的肽链上几个能形成二级结构或疏水簇的位点上开始 形成与伸展态快速互变的不稳定的局部构象 在0 01秒内 这些局部结构因素非专一地扩散 碰撞 粘结 形成较大的结构 稳定性也有所增强 接着 进一步卷曲形成一系列含有稳定的二级结构和疏水核的卷曲中间态 称为熔球态 moltenguobulestate 约需1秒 最后 进一步卷曲 调整 形成天然构象 包括二硫键的重排和脯氨酸残基的顺反异构等慢反应 1 3 1 3卷曲所需的有关蛋白因子 在活体内 蛋白质的卷曲还需要两类有关蛋白因子的参与 一类可加速卷曲过程的慢反应 如蛋白质二硫键异构酶 肽酰脯氨酰顺反异构酶等 帮助蛋白质克服卷曲中的限速步骤 大大减少新生肽链的水解和卷曲中间体的聚集 第二类参与多肽链的伸展与再卷曲 稳定和保护卷曲中间态 促进其跨膜运输 称为分子伴侣 molecularchaperone PDI ProteinDisulfideIsomerase蛋白质二硫键异构酶 一种可以使错误连接的 S S 二硫键 断裂形成正确的 S S 的酶类 MolecularChaperones分子伴侣 在细胞内蛋白的折叠需要分子伴侣的协助 蛋白质以多肽链的形式被合成出来后 要形成特定的立体结构后才有生理活性 拥有生理活性的立体结构对每种蛋白质而言 是特定的和唯一的 通常称之为天然结构 nativestructure 蛋白质的天然立体结构在溶液中有一定的可塑性 弹性 有些蛋白质被合成以后 自己不能独立形成自由能最低的立体结构 而需要一类蛋白质来催化 这类蛋白质称为分子伴侣 molecularchaperone 1 3 2热休克蛋白与分子伴侣 帮助其他含多肽结构的物质在体内进行正确的组装 并且不是组装后的结构发挥其正常的生物功能的组分 它们是结构可以完全相同 也可以完全不同的蛋白质的总称 其中最大的一类分子伴侣是热休克蛋白 heatshockproteins HSP 1 3 2 1热休克蛋白的分类1 3 2 1 1Hsp70族 1 3 2 1 2Hsp60族和TRiC族 1 3 2 1 3Hsp90族和Hsp110族 1 3 2 1 4LMWHsp族 热休克蛋白的发现 1992年Horwitz提出HSP是一种分子伴侣的理论 目前HSP的作用和功能已经引起世界各国学者的广泛关注 尤其是对HSP70的研究最为深入 HSP首先是在果蝇体内发现的 1962年Ritossa发现 将果蝇的培养湿度从25 提高到30 热休克环境温度升高 30分钟后就可在多丝染色体上看到蓬松现象 或称膨突puff 提示这些区带基因的转录加强并可能有某些蛋白质的合成增加 1974年Tissieres研究证实该现象的产生是因为温度高增强了这一区域的基因转录 相应生成了一系列分子量为70kDa和26kDa的蛋白质这些蛋白质被命名为热休克蛋白质 HSP 热休克蛋白 Hsp 是广泛表达的多肽 其表达对应于多种不同的代谢刺激而增加 虽然命名如此 但大多数热休克蛋白是组成性表达并执行基本的功能 最引人注意的是它们的分子伴侣作用 在整个细胞中促进蛋白质的合成和折叠 此外 有研究显示热休克蛋白参与蛋白质装配 分泌 运输 蛋白质降解以及对转录因子及蛋白激酶的调控 应激后热休克蛋白水平增加在细胞的稳定性中起着重要作用 1 3 2 2热休克蛋白的分子伴侣功能 科学家揭开南极抗冻鱼在极寒环境下生存的面纱 研究人员分析了使鱼类能够在寒冷 富含氧气的环境中生活的蛋白质在南极抗冻鱼体内表达水平更高 有一些特殊组织仅简单地由某些特定的蛋白质表达 为了更好地证实是否这种基因在抗冻鱼体内 进行调控 可增强其幸存冰冷海域的能力 对比了抗冻鱼和其他几种暖水鱼类 他们发现抗冻鱼的多数基因表达与暖水鱼相差很大 当他们分析这种上调基因时 研究人员发现许多蛋白质的编码表达是为了响应外界环境压力 有很多是分子伴侣蛋白质 chaperoneproteins 包括 热休克蛋白质 heatshockproteins 比如 此类蛋白质可以保护其它蛋白质免遭极端寒冷或炽热环境的损害 HSP70是分子量约70kD的热休克蛋白 是热休克蛋白家族中组重要的一员 被称为主要热休克蛋白 包括分子量为68 72 73 75 78kDa等的20多种蛋白 此外 在哺乳动物细胞中还发现了一类广泛存在的HSP70家族的一个亚族 HSP110 HSP70家族蛋白具有相同的等电点和相似的胰蛋白酶肽谱 在几乎所有生物的应激细胞中常被高度诱导 具有保护机体和细胞的功能 Hsp10Hsp27Hsp32Hsp40和DnaJ家族Hsp60和GroEL 伴侣素 Hsp70和DnaKHsp90Hsp110伴侣蛋白及其他 Hsp10 Hsp10 又称伴侣素10 Cpn10 是哺乳动物对应于细菌GroES基因产物的 10kDa同等物 Hsp10以寡聚体在体内存在并与Hsp60相互作用 后者是细菌GroEL蛋白的哺乳动物同系物 Hsp10 Hsp60伴侣素一起存在于线粒体中促进新合成蛋白质的折叠并可能参与受应激损伤的蛋白质的重新折叠 在植物中 一个类似的伴侣素系统在叶绿体中运作 称为Rubisco结合蛋白 最后 在细菌中GroEL和GroES参与很多蛋白质的折叠和装配 Hsp27 Hsp27 有时亦称Hsp20 Hsp25 Hsp28或低分子量热休克蛋白 是 晶状体蛋白质的同系物 这两个家族的蛋白质均以其寡聚体结构为特征并被认为具有不依赖ATP的伴侣蛋白功能 Hsp27结构 功能受不同蛋白激酶介导的磷酸化作用的调节 除了其伴侣蛋白功能 有研究显示Hsp27和 B晶状体蛋白还介导结构完整性和膜稳定性 影响肌动蛋白聚合 干预纤丝组构 细胞凋亡和侵入潜能 有证据提示小热休克蛋白表达的改变牵涉人类疾病包括癌症 白内障 神经变性机能紊乱和心血管疾病的发病机制 Hsp32 血红素加氧酶 血红素加氧酶或Hsp32是亚铁血红素分解代谢中的主要成分 催化亚铁血红素向胆红素降解的第一步 血红素加氧酶至少包括3个亚型 应激诱导的HO 1和组成性表达的HO 2与HO 3 HO 1的诱导因素包括热休克 氧化应激 巯基反应试剂 重金属 炎症介质和某些生长因子 该蛋白质大多数位于内质网 但亦可存在于胞质膜和线粒体 血红素加氧酶生成的产物具有重要的生理学效应 一氧化碳是有效的血管舒张剂 胆绿素及其产物胆红素是抗氧化剂 释放的铁如果不被有效再利用则能增进氧化应激 对HO表达的调节可能有助于保护机体抵抗动脉粥样硬化症 氧化应激 冠状局部缺血 高血压和某些神经变性疾病 Hsp40和DnaJ家族 存在于胞质溶胶的哺乳动物Hsp40是众多与DnaJ蛋白密切相关的家族成员之一 后者首次描述于大肠杆菌 Hsp40 DnaJ家族成员与Hsp70 DnaK蛋白协作 促进ATP向ADP的水解 从而帮助Hsp70伴侣蛋白锁定其所结合的蛋白质底物 因此 真核生物Hsp70家族的每个不同成员需要一个特定的DnaJ同系物以发挥它们的伴侣活性 在酵母中已鉴定出20多个编码DnaJ相关蛋白的基因 在动物细胞 Hsp40家族蛋白表现出广泛的组织分布 各成员存在于大多数细胞内腔室中 Hsp60和GroEL 伴侣素 热休克蛋白Hsp60 真核生物 和GroEL 细菌 家族的成员是一些被研究得最充分的分子伴侣 细菌GroEL 因其在噬菌体生长中的重要作用而命名 以大的同寡聚体复合体的形式存在 识别和结合未折叠的多肽 通过与其特定的辅助因子 真核生物中为Hsp10 细菌中为GroES 组合 Hsp60 GroEL蛋白与新合成的多肽结合 并经一轮或多轮ATP水解作用促进其折叠成天然状态 哺乳动物Hsp60定位于线粒体内 而一个相关的名为Rubisco结合蛋白的蛋白质则在植物叶绿体内运作 最后 在真核生物胞质溶胶内 名为CCT或TRIC的相关蛋白形成异寡聚体结构 并显示类似的有选择地结合蛋白质底物并促进其折叠和 或更高级别的装配 通常GroEL ES或Hsp60 Hsp10蛋白质折叠机器也被称为伴侣素 有研究显示 体外及体内伴侣素 或者单独或者与其他伴侣蛋白和ATP一起 协调特定变性蛋白质的重新折叠 除了作为分子伴侣的突出作用 GroEL和Hsp60家族的成员长期以来也被认为是高免疫原性蛋白并因而吸引了免疫学家们的许多注意力 Hsp70 热休克蛋白的Hsp70 猪气喘病的病原DnaK 家族包括众多同系物 分子量大小从66kDa到78kDa 这些蛋白质包括见于细胞内大部分腔室的同族成员以及高度可诱导的主要分布于细胞质或细胞核的亚型 所有Hsp70家族成员含有一个高度保守的N末端ATP酶结构域 以及一个保守的疏水的肽结合结构域 PBD 和更为多变的 螺旋 帽 结构域 Hsp70的激活受N末端ATP结合的协调 后者引起构象变化而将帽打开 允许PBD与多种多样的客户蛋白在未折叠 错误折叠或变性状态下相互作用 Hsp70ATP酶活性受缔合何种特定辅助伴侣蛋白分子的的影响 后者包括Hsp40 Hip Hop Hup Hap和CHIP 这些辅助伴侣蛋白与Hsp70合作折叠新合成的蛋白质 重新折叠错误折叠的或变性的蛋白质 协调蛋白质的跨细胞膜运输 拆卸笼形蛋白包裹的小泡 抑制蛋白质聚集体以及瞄准经蛋白酶体途径的蛋白质降解 Hsp70水平的升高与细胞凋亡的抑制相关联 而Hsp70的表达与细胞弱分化 淋巴结转移灶增加 药物抗性以及不佳的临床结果之间的临床相关性则表明Hsp70可能在诊断 预后和治疗人类恶性肿瘤中有功用 HSP70 一些较小的分子伴侣从蛋白质离开核糖体那一刻起就开始保护它们 在这个阶段 蛋白质还没有形成折叠结构 伸展的肽链上暴露出许多富含碳的基团 很容易造成聚集沉淀 HSP 70能够识别并结合于这些疏水基团 从而避免其与周围基团的聚合 当多肽链开始折叠时 HSP 70由ATP供能 从肽链上释放出来 HSP70 HSP 70由两个结构域组成 一个结构域 蛋白质编号1dkg 是ATP的结合位点 并且控制ATP的结合过程 分子结构如图A所示 另一个结构域 蛋白质编号1dkz 是富含碳的肽链的结合位点 分子结构如图B所示 图中以粉色表示的小肽段是蛋白质结合的缝隙图底部的水母状结构的前折叠因子 蛋白质编号1fxk 也执行类似的功能 即包裹折叠过程中的蛋白质链 A B 目前 HSP70被认为是哺乳动物细胞HSPs中最重要 也是研究最为深入的HSPs家族 这与它所具有的生物学特性密切相关 HSP70 生物界的普遍性 从原核生物到真核生物都有HSP70的表达 同一生物体内的不同组织内亦均有表达 高度的保守性 不同生物来源的HSP70氨基酸序列有50 90 的同源性 而且HSP70氨基酸序列的N端2 3部分较C端1 3部分还要保守得多 正常情况下HSP70在细胞内呈基础表达 表达水平较低 而在高温及各种有害应激状态下 HSP70的合成速度显著增加 一般数分钟内即可达到最高水平 而原来的蛋白质合成则减少 以提高生物体的抗应激能力 正常情况下HSP70位于细胞浆内 当细胞遭受应激作用时 HSP70迅速移入细胞核内并包围核仁 细胞浆内只有少量存在 而应激消除后细胞处于恢复阶段时 细胞核内HSP70又返回胞浆 在细胞浆6内呈低水平表达 再次应激又重新返回细胞核 HSP70家族成员在细胞内的分布不同 但均具有与核苷酸特别是与ADP或ATP结合的特性 热休克蛋白的合成过程 目前认为HSP的合成过程如下 应激因素导致细胞浆内的部分蛋白质变构或变性 变性的蛋白质分子启动一种叫热休克蛋白因子 heatshockfactor HSF 的蛋白质磷酸化并聚合形成三聚体 进入细胞核并与位于HSP基因增强子中的热休克元素 heatShockElement HSE 相结合 这一过程可激活增强子转录mRNA合成 并进一步合成HSP 新合成的HSP与变性的蛋白质结合 并反馈抑制HSP的合成 在应激状态下HSP70可显著升高 热休克蛋白的主要功能 分子伴侣功能 热休克蛋白在细胞中执行最基本的生理功能 如蛋白质折叠 伸展 转运 寡聚体的形成和解聚等 维持细胞的生存和功能 在应激的不利条件下 提高细胞的抵抗力 起到应激保护作用 在基本的蛋白质伸展 折叠过程中发挥作用 作为细胞内许多功能蛋白的结合蛋白发挥复杂的作用 细胞保护作用 分子伴侣是细胞中一大类蛋白质 是由不相关的蛋白质组成的一个家系 它们介导其它蛋白质的正确装配 但自己不成为最后功能结构中的组分 分子伴侣的概念有3个特点 凡具有这种功能的蛋白 都称为分子伴侣 尽管是完全不同的蛋白质 作用机理是不清楚的 故用了 介导 二字 以含糊其辞 帮助 二字可理解为 通过催化的或非催化的方式 加速或减缓组装的过程 传递组装所需要的空间信息 也可能抑制组装过程中不正确的副反应 分子伴侣一定不是最终组装完成的结构的组成部分 但不一定是一个分离的实体 如一些蛋白水解酶的前序列 以及一些核糖核蛋白体的加工前的部分 若具分子伴侣的作用 也称为分子伴侣 组装的涵意比较广 主要指 帮助新生肽的折叠 帮助新生肽成熟为活性蛋白 帮助蛋白质跨膜定位 亚基组装等 E coli分子伴侣GroEL GroES在蛋白质