羊藿素对三种人肿瘤细胞增殖抑制机制的比较研究.doc

。淫羊藿素对三种人肿瘤细胞增殖抑制机制的比较研究张淑琴1 李沙沙2 郑倩2 黄佳彬2杨广笑2 何光源2 陈明洁2l 基金项目：武汉市科技攻关计划(201260523185)，国家科技部国际科技合作项目（2009DFB20290）l 第一作者：张淑琴（1967-），女，副主任医师，研究方向：神经免疫与变性病，430015，E-mail：通讯作者：陈明洁（1968-），女，副教授，硕导，研究方向：生化与分子生物学，430074，E-mail：(1武汉市六医院，江汉大学附属医院；2科技部国际科技（基因工程）合作基地，华中科技大学生命科学与技术学院)摘要： 目的 比较淫羊藿素对人肝癌HepG2细胞、人肺癌A549、人肾癌细胞786-O等三种人肿瘤细胞增殖的抑制效果，并探索其作用机理。 方法 通过MTT法比较淫羊藿素对HepG2、A549、786-O肿瘤细胞增殖的影响，流式细胞仪检测并确定淫羊藿素对肿瘤细胞凋亡的影响。Western blot法检测淫羊藿素处理前后细胞增殖和凋亡相关蛋白合成的变化。 结果 淫羊藿素均时间和浓度依赖性地抑制三种人肿瘤细胞的增殖，其中对人肾癌细胞786-O的抑制效果最为明显；淫羊藿素促进三种肿瘤细胞凋亡；抑制周期相关蛋白cyclin A、cyclinD1、cyclinE、CDK2和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，提高促凋亡蛋白Bax的表达。 结论 淫羊藿素在体外能明显抑制三种人肿瘤细胞的增殖，诱导其凋亡，对786-O效果最为显著；它通过调节细胞增殖和凋亡相关蛋白的表达来完成。关键词：淫羊藿素；人肝癌HepG2细胞；人肺癌A549；人肾癌细胞786-O；增殖；凋亡；机制淫羊藿为小檗科淫羊藿属多年生草本植物，是中药方剂中常用到的一味中药，具有温肾壮阳、强筋骨、祛风湿的功能，用于治疗肾虚阳痿、宫冷不孕、风湿痹痛等多种疾病。淫羊藿素Icaritin为淫羊藿的主要成分，研究发现，淫羊藿素具有多种药理作用，如保护神经系统1、启动心脏分化2、改善骨损伤3、提高免疫力4、抗肿瘤5, 6等多种功效。目前从植物中寻找新型高效低毒的抗癌药物已经成为当今新药研制的热点，迄今为止，淫羊藿素已被用于抗乳腺癌、肝癌、子宫内膜癌、慢性粒细胞白血病等多方面的研究5-8，取得了较好进展，但其分子机理尚不清楚。本文使用淫羊藿素处理人肝癌HepG2细胞、人肺癌A549、人肾癌细胞786-O等三种人肿瘤细胞，观察其对细胞生长、凋亡的影响，检测细胞中生长、凋亡相关蛋白表达的变化，对其作用机理开展了初步探索，为淫羊藿素抗肿瘤新药的研制奠定理论基础。1 实验材料1.1 试剂 淫羊藿素购自上海融禾医药有限公司，胰蛋白酶（Typsin）、MTT以及DMSO均购自Sigma公司。无支原体胎牛血清购自杭州四季青公司，青霉素-链霉素溶液购自安特捷生物技术有限公司。Annexin-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司， GAPDH、CDK2、cyclin A、cyclinD1、cyclinE、Bax、Bcl-2等多克隆抗体购于Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体购于武汉博士德生物工程公司。1.2 细胞培养 人肝癌细胞系HepG2和肺癌细胞系A549购自中国典型培养物中心CTCC，人肾癌细胞系786-O购自美国典型培养物中心ATCC。三种细胞系均用含10%无支原体胎牛血清和1%双抗（青霉素-链霉素溶液）的DMEM高糖培养基，37、5CO2的细胞培养箱中培养。2 方法2.1 细胞增殖测定 采用MTT（噻唑蓝）法检测细胞增殖。细胞培养至对数生长期，消化计数，接种至96孔板2104个/孔，待细胞贴壁后，更换含有不同浓度淫羊藿素的新鲜培养基，继续培养24h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 L，孵育4 h后弃上清，每孔加入100 L DMSO，37暗培养15 min后，于490nm测定光吸收值，以完全培养基为空白对照。细胞增殖率=(处理组吸光值/对照组吸光值)1O0。2.2细胞凋亡检测 采用AnnexinV-FITC/PI双染法和流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡。细胞培养至对数生长期，消化计数，接种至6孔板2105个/孔，细胞贴壁后，更换含有淫羊藿素的新鲜培养基处理一定时间后，收集细胞、PBS洗涤、500 L缓冲液重悬细胞，加入5 L AnnexinV-FITC和10 L PI，混匀后室温避光孵育15 min，于l h内用流式细胞仪检测。2.3蛋白表达分析 采用Western Blot检测与细胞生长和凋亡相关的蛋白表达情况。细胞培养至对数生长期，消化计数，接种至6孔板1105个/孔，淫羊藿素处理24 h后，收集细胞、裂解细胞、提取蛋白。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度，据此计算蛋白电泳上样量。每孔上样30 g蛋白进行10% SDS-PAGE分离，电泳结束后通过电转移转至硝酸纤维素膜上，4封闭过夜，洗膜后分别以1:200 和1:500比例加入特定抗体进行一抗和二抗于室温孵育2 h，TBST洗膜后，显影定影。2.4 统计学分析 上述实验均重复三次，采用 t 检验，所有数据均采用SPSS10.0软件进行统计学分析。3 结果3.1 淫羊藿素对三种肿瘤细胞增殖的影响 用MTT法检测不同浓度淫羊藿素处理三种人肿瘤细胞24h和48h后细胞增殖的变化情况，图1结果表明，在试验浓度范围内，淫羊藿素对三种人肿瘤细胞增殖均呈现浓度和时间依赖性抑制作用；淫羊藿素对人肾癌细胞786-O增殖的抑制效果最为显著，5M淫羊藿素处理24 h细胞增殖抑制率达44%，半抑制浓度IC50为5.85 M，48 h IC50为3.76M；对于HepG2和A549细胞，淫羊藿素处理48h的抑制效果显著，半抑制浓度IC50分别为30.4M和32.6M (P 001)。图1 淫羊藿素处理24h和48h三种人肿瘤细胞增殖率的变化3.2 淫羊藿素对三种肿瘤细胞凋亡的影响 通过AnnexinV-FITC/PI双染法和流式细胞术检测，结果表明，淫羊藿素处理后，三种细胞均出现明显凋亡现象，且呈现浓度依赖性，如图2所示，当30mM淫羊藿素分别处理HepG2和A549两种肿瘤细胞48h后，细胞凋亡比率分别达到了51.1 %和49.1 %，而淫羊藿素诱导786-O细胞凋亡的效果更为明显，10 mM淫羊藿素处理24h后，凋亡细胞比率达到45.8%(P 001)。图2 淫羊藿素对三种人肿瘤细胞凋亡的诱导3.3 蛋白表达分析 Western Blot检测结果表明，淫羊藿素处理24 h后，三种肿瘤细胞中与细胞生长和凋亡相关的蛋白表达发生变化，HepG2和A549细胞均呈现细胞周期蛋白cyclin A、CDK2和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调，促凋亡蛋白Bax上调；而786-O细胞呈现cyclinD1、cyclinE和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调以及促凋亡蛋白Bax表达上调。三种细胞中相关蛋白的表达水平的变化随着淫羊藿素浓度的增加而加强（见图3）。图3 淫羊藿素对三种人肿瘤细胞相关蛋白表达的影响4 讨论癌症是严重危害人类健康和生命的恶性疾病，在我国肺癌、肝癌、肾癌的发病率和死亡率占据成年恶性肿瘤发病率前十位，并呈逐年攀升和年轻化趋向。癌症的治疗方法虽然包括放疗、化疗、手术治疗、生物治疗、分子靶向治疗等多种手段，但是其安全性、有效性等方面存在诸多问题，癌症的治疗仍然是临床面临的一个挑战，迫切需要开发更为安全有效的治疗手段和药物。传统的中医药具有几千年的临床应用历史，在防治肿瘤方面积累了丰富的临床用药经验，随着现代肿瘤防治向综合治疗方向的转变，传统中医药的研究备受关注。淫羊藿素作为一种黄酮类药物，以其安全性好、多靶点治疗的优势近年来在抗癌研究中多有报道。MTT法是检测药物对细胞增殖影响的常用方法，本研究中MTT检测结果表明，淫羊藿素对三种肿瘤细胞均有较为明显的抑制增殖作用，特别是对于人肾癌细胞786-O在较低剂量即具有显著效果，淫羊藿素作用24 h的半抑制浓度仅为4.74M。促进细胞凋亡是抑制肿瘤的另一个重要手段。研究发现，淫羊藿素明显促进三种肿瘤细胞凋亡，同样以促786-O细胞凋亡效果最为显著，10M淫羊藿素作用24 h即导致45.8%的细胞凋亡率。进一步探索其作用机制，发现淫羊藿素下调节细胞周期蛋白cyclin A、cyclinD1、cyclinE、CDK2和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时上调促凋亡蛋白Bax的表达，而且呈浓度依赖性，据此推断，淫羊藿素通过降低细胞周期蛋白的表达实现细胞周期阻滞，从而抑制细胞增殖；同时，淫羊藿素降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达、提高促凋亡蛋白Bax的表达，诱导肿瘤细胞凋亡。历代本草的记载中显示，淫羊藿素具有补肾阳、强心力、坚筋骨等价值，作为一种传统补药而广泛运用。本研究通过比较淫羊藿素对三种肿瘤细胞的作用效果，发现其对人肾癌细胞效果最为显著，这与我国传统中医药的临床效果相吻合。肾细胞癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，具有高转移性、强免疫性的特点，由于肾癌细胞的生物学特性及多重耐药性，肾癌细胞对放疗与化疗均不敏感，以往应用放疗、化疗、激素治疗均不能改善肾癌患者的术后生存率，疗效不容乐观，因此迫切需要研究更为安全有效的治疗方法。本研究结果为淫羊藿素的临床研究提供了一定的理论基础，显示了淫羊藿素成为抗癌药物的潜力，尤其对于肾癌的治疗具有较大的开发价值。中国具有非常丰富的淫羊藿素资源，其资源占有率高达世界总量的80%。本研究仅对淫羊藿素对癌细胞的作用进行了粗浅的研究，相信深入开展淫羊藿素抗癌机制研究，加速新型抗癌药物的开发进程，将会创造巨大的社会效益与经济价值。参考文献1. 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European journal of pharmacology, 2011, 658: 114-122.Comparative Study on the Mechanism that Icaritin Inhibits Proliferation of Three Human Carcinoma Cell LinesShuqin Zhang1, Shasha Li2, Qian Zheng2, Jiabin Huang2, Guangxiao Yang2, Guangyuan He2, Mingjie Chen2（1 No.6 Hospital of Wuhan City, Jianghan University Affiliated Hospital; 2 The Genetic Engineering International Cooperation Base of Chinese Ministry of Science and Technology, College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science & Technology）Abstract：Objective To compare the effect of Icaritin on proliferation of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2，human lung carcinoma cell line A549 and human renal cell carcinoma cell line 786-O cells and study the mechanism during those processes. Methods MTT assay was used to test the effect of Icaritin on proliferation of HepG2，A549 and 786-O cells. Apoptosis of the cells was detected by Flow cytometry. The expression of several key prolife