毛霉的分离和豆腐乳的制备.doc

09食品（1）班卓凯200924103134毛霉的分离和豆腐乳的制备一、 实验目的：1、 学习毛霉的分离和纯化方法。2、 学习毛霉菌种的扩大培养过程及技术。3、 掌握豆腐乳发酵的工艺过程。4、 观察豆腐乳发酵过程中的变化。二、 实验原理：1 毛霉又叫黑霉、长毛霉。菌丝为无隔膜的单细胞，多核，以孢囊孢子和接合孢子繁殖。毛霉的菌丝体在基质上或基质内能广泛蔓延，有假根和匍匐枝，孢囊梗直接由菌丝体生出，一般单生，分枝较少或不分枝。分枝顶端都有膨大的孢子囊，囊轴与孢囊梗相连处无囊托。孢囊孢子成熟后，孢子囊壁破裂，孢囊孢子分散开来。毛霉菌丝初期白色，后灰白色至黑色，这说明孢子囊大量成熟。 2 毛霉在土壤、粪便、禾草及空气等环境中存在。毛霉的代谢类型是异养需氧型.在高温、高湿度以及通风不良的条件下生长良好。毛霉的用途很广，常出现在酒药中，能糖化淀粉并能生成少量乙醇，产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，我国多用来做豆腐乳、豆豉。许多毛霉能产生草酸、乳酸、琥珀酸及甘油等，有的毛霉能产生脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。常用的毛霉主要有鲁氏毛霉和总状毛霉。3 毛霉腐乳：以豆腐坯培养毛霉，进行发酵，使白色菌丝长满豆腐坯表面，形成坚韧皮膜，积累蛋白酶，为腌制装坛后期发酵创造条件。4 毛霉的分离与纯化：在无菌操作的条件下称取25克长满毛霉菌丝的豆腐坯，放入盛有225毫升无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，摇匀，制成孢子悬液，用接种环取该孢子悬液在PDA平板表面作划线分离，于20度培养12d，以获取单菌落，同时将细胞涂片，镜检是否为单一的毛霉细胞，若发现有杂菌，须再次进行分离与纯化，直到获得纯培养。5 豆腐乳是我国独特的传统发酵食品，是用豆腐发酵制成。民间老法生产豆腐乳均为自然发酵，现代酿造厂多采用蛋白酶活性高的鲁氏毛霉或根霉发酵。豆腐坯上接种毛霉，经过培养繁殖，分泌蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶等复杂酶系，在长时间后发酵中与淹坯调料中的酶系、酵母、细菌等协同作用，使腐乳坯蛋白质缓慢水解，生成多种氨基酸，加之由微生物代谢产生的各种有机酸，与醇类作用生成酯，形成细腻、鲜香等豆腐乳特色。三、 实验器材1. 菌种：腐乳毛霉2. 培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），豆渣，麸皮培养基3. 无菌水、培养皿、250ml三角烧瓶、接种环、铲、接种针、小笼格、喷枪、小刀、带盖广口玻瓶、显微镜、恒温培养箱等四、 流程毛霉斜面菌种 扩大培养 孢子悬浮液 喷洒豆腐 豆腐坯 接种 晾花 加盐 腌坯 装瓶 后熟 成品1.毛霉的分离配制培养基 毛霉分离 观察菌落 显微镜检2.豆腐乳的制备悬液制备 接种孢子 培养与晾花 装瓶与压坯 装坛发酵 感官鉴定五、 实验步骤及技术操作1. 毛霉分离1.1制备培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），经配制、灭菌后倒平板备用。1.2毛霉的分离在无菌操作的条件下称取25克长满毛霉菌丝的豆腐坯，放入盛有225毫升无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，摇匀，制成孢子悬液，用接种环取该孢子悬液在PDA平板表面作划线分离，于20度培养12d，以获取单菌落。1.3初步鉴定（1）菌落观察 呈白色棉絮状，菌丝发达。（2）显微镜检 于载玻片上加1滴石碳酸液，用解剖针从菌落边缘挑取少量菌丝于载玻片上，轻轻将菌丝体分开，加盖玻片，于显微镜下观察孢子囊、梗的着生情况。若无假根和匍匐菌丝、或菌丝不发达，孢囊梗直接由菌丝长出，单生或分枝，则可初步确定为毛霉。2. 纯的母种试管种的制备2.1制备培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），经配制、分装于试管中、灭菌后、搁置斜面备用2.2制备纯母种挑取毛霉单个菌落接入斜面培养基，于25下培养3天。3. 菌种的三角瓶扩大培养3.1豆渣、麸皮培养基的配制将豆渣、麸皮以3：1或者2：1的比例和水分60%或以上搅匀。装入三角瓶，装12厘米的瓶高度即可且要疏松。然后把瓶口洗干净，塞好棉花塞，用纸包扎好。在121摄氏度下灭菌40分钟。3.2接种灭菌后要待包扎瓶口的纸干燥后并且要使温度下降到15摄氏度以下才可接种。灭菌后的基料变实，应打散培养基，然后加半匙的试管菌种进去，用接种钩搅匀培养基料和孢子粉。3.3培养在225摄氏度下培养2天，温度不可过高。培养至菌丝和孢子生长旺盛，备用。4. 豆腐乳的制备4.1孢子悬液的制备于上述三角瓶中加入无菌水200mL，用玻璃棒搅碎菌丝，用无菌双层纱布过滤，滤渣倒回三角瓶，再加200 mL无菌水洗涤1次，合并滤液于第一次滤液中，装入喷枪贮液瓶中供接种使用。4.2接种孢子用刀将豆腐坯划成4.1cm4.1cm1.6cm的块，将笼格经蒸汽消毒、冷却，用孢子悬液喷洒笼格内壁，然后把划块的豆腐坯均一竖放在笼格内，块与块之间间隔2cm。再用喷枪向豆腐块上喷洒孢子悬液，使每块豆腐周身沾上孢子悬液。接种温度不宜过高，一般允许在40454.3培养与晾花（前发酵）将放有接种豆腐坯的笼格放入培养箱中，于25左右下培养，培养20h后，每隔6h上下层调换一次，以更换新鲜空气，并观察毛霉生长情况。4448h后，菌丝顶端已长出孢子囊，腐乳坯上毛霉呈棉花絮状，菌丝下垂，白色菌丝已包围住豆腐坯，此时将笼格取出，使热量和水分散失，坯迅速冷却，其目的是增加酶的作用，并使霉味散发，此操作在工艺上称为晾花。此过程需要特别注意保温、保湿、供养，才能使毛霉生长旺盛。4.4装瓶与压坯（腌胚）将冷至20以下的坯块上互相依连的菌丝分开，用手指轻轻地每块表面揩涂一遍，使豆腐坯上形成一层皮衣，装入玻璃瓶内，边揩涂边沿瓶壁呈同心圆方式一层一层向内侧放，摆满一层稍用手压平，撒一层食盐，每100块豆腐坯用盐约400g，使平均含盐量约为16%，如此一层层铺满瓶。下层食盐用量少，向上食盐逐层增多，腌制中盐分渗入毛坯，水分析出，为使上下层含盐均匀，腌坯34d时需加盐水淹没坯面，称之为压坯。腌坯周期冬季13d，夏季8d。4.5 装坛发酵（后发酵）：将腌坏沥干，待坯块稍有收缩后，加酒水，将配方配制的汤料注入瓶中，淹没腐乳，加盖密封，在常温下贮藏24个月成熟。4.5.1红方 按每100块坯用红曲米32g、面曲28g、甜酒酿1kg的比例配制染坯红曲卤和装瓶红曲卤。先用200g甜酒酿浸泡红米和面曲2d，研磨细，再加200g甜酒酿调匀即为染坯红曲卤。将腌坯沥干，待坯块稍有收缩后，放在染坯红曲卤内，六面染红，装入经预先消毒的玻瓶中。再将剩余的红曲卤用剩余的600g甜酒酿兑稀，灌入瓶内，淹没腐乳，并加适量面盐和50度白酒，加盖密封，在常温下贮藏6个月成熟。 4.5.2白方 将腌坯沥干，待坯块稍有收缩后，将按甜酒酿0.5kg、黄酒1kg、白酒0.75kg、盐0.25kg的配方配制的汤料注入瓶中，淹没腐乳，加盖密封，在常温下贮藏24个月成熟。5. 质量鉴定将成熟的腐乳开瓶，进行感官质量鉴定、评价。6. 结果从腐乳的表面及断面色泽、组织形态（块形、质地）、滋味及气味、有无杂质等方面综合评价腐乳质量。六、 实验结果实验做出的腐乳是颜色微黄，成块，有豆腐香，口感舒爽的。七 体会学会了菌种的分离纯化方法和豆腐乳的制备方法。实验的成果可以自己直接品尝，感到能这个实验能在生活中学以致用，学这个实验的过程实际上是掌握一门技术的过程。也更进一步增加了对食品微生物学的兴趣。八 注意事项1. 斜面菌种的培养时，温度不可过高，应在30以下，否则菌丝会发生自溶，通常3天即可形成大量孢子。2. 若菌种在冰箱中长期放置后取出，菌体已经溶解，其中会含有细菌，应进行分纯，培养两天后挑菌最好。（以PDA为培养基）3. 毛霉是好氧细菌，扩大培养中，培养基不可装入太多，最好厚度在12厘米，使之有较大的空气接触面积以确保有氧气供给毛霉。灭菌后，基料变实，应将其打散后再接种孢子粉，注意要将培养基和孢子粉充分拌匀搅松。4. 接种过程应该将菌种在培养基上或豆胚上分布得充分均匀。5. 在培养与凉花过程注意通风更换新鲜空气，以免产生霉味等异臭味，也需要特别注意保温、保湿，才能使毛霉生长旺盛。6. 腌胚时可以用饱和盐，腌制两天后，用冷开水冲洗，再装瓶。7. 在装瓶与腌坯的过程中：在豆腐坯上相互依联的菌丝分开，又手指轻轻在每块表面揩涂一遍，使豆腐坯上形成一层皮衣。九 讨论（1）腐乳生产主要采用何种微生物答：主要采用鲁氏毛霉或根霉。（2）腐乳生产发酵原理是什么？答：豆腐坯上接种毛霉，经过培养繁殖，分泌蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶等复杂酶系，在长时间后发酵中与淹坯调料中的酶系、酵母、细菌等协同作用，使腐乳坯蛋白质缓慢水解，生成多种氨基酸，加之由微生物代谢产生的各种有机酸，与醇类作用生成酯，形成细腻、鲜香等豆腐乳特色。（3）试分析腌坯时所用食盐含量对腐乳质量有何影响？ 答：在