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原生质体融合育种摘要 原生质体融合育种克服了远缘杂交不亲和的障碍，可以提高重组频率，使得遗传物质的交换、传递更完整，成为微生物育种的一种重要方式。其过程包括原生质体制备和再生、原生质体融合以及融合体检出等步骤。在每个步骤中均要考虑到其应注意的因素，从而提高原生质体育种的效率，达到快速育种的目的。因原生质体融合育种的优势，其在多功能菌种选育、工程菌选育和工业生产育种等方面应用广泛。关键词 原生质体制备 融合育种 原生质体再生 融合体检出引言传统的杂交育种具有一定的局限性，需要受到亲和力的影响，并且要求亲本有性的分化，而原生质体育种则克服了这些缺点。当细菌细胞壁被剥离，剩下由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。原生质体融合是指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。1原生质体融合不受种属限制，能够完整的传递遗传物质，使得重组几率提高进而提高育种速度。1-2育种步骤可分为五大步骤：直接亲本及其遗传标记的选择、双亲本原生质体制备和再生、亲本原生质体诱导融合、融合重组体分离、遗传标记分析和测定。1.亲本遗传标记的选择进行原生质体融合的双亲本一般要携带遗传标记，以顺利地筛选到融合子。常用营养缺陷型、抗性、荧光染色、温度敏感性、孢子颜色、菌落形态等作为标记。其中营养缺陷型是常用而有效的选择手段。32.原生质体制备制备原生质体是融合育种的前提，为了制备原生质体，需要将包围细胞的细胞壁去除掉。去壁的方法很多，主要有机械法、酶法和非酶法，现在使用较多的是酶法。42.1酶法制备原生质体的条件（1）菌体年龄 微生物的生理状态决定了原生质体的形成，而菌龄明显影响了原生质体的形成率，菌龄过长不利于释放原生质体，过短则菌丝体容易破裂。丝状真菌一般选择年轻的尖端生长点的菌丝；细菌与霉菌一般采用对数生长期，而放线菌以对数期到静止期的转换期为好。5（2）稳定剂 原生质体由于失去了细胞壁因此对环境十分敏感，渗透压尤为重要。去壁后的原生质体必须保存在高渗的稳定剂中才会保证不被胀裂。稳定剂分为两类：一类是盐溶液，包括nacl、kcl、mgso4、cacl2等，浓度为0.31.0mol/l；一类是糖溶液，包括蔗糖、甘露醇、山梨醇、木糖、纤维二糖、鼠李糖等，浓度为0.30.6mol/l。易于渗入细胞膜或易被分解的物质不宜作为稳定剂。酵母菌、细菌和放线菌宜用糖溶液，丝状真菌宜用盐溶液。5（3）酶解前预处理 在使用酶进行酶解细胞壁时，要使酶渗透到细胞壁中。然而微生物的细胞壁具有保护自身的结构，因此在没处理前要进行预处理。对于酵母菌和丝状真菌，可以使用sh-化合物，还原细胞壁中蛋白的二硫键，是肽链间断开连接，没分子容易渗入；对于放线菌，可在培养集中加入甘氨酸，使形成细胞壁时甘氨酸错误替代丙氨酸而干扰细胞壁网状结构的形成；对于细菌，可使用亚抑制量的青霉素，抑制细胞壁黏肽的合成，有利于酶对细胞壁的水解作用。（4）酶系和酶浓度 各种微生物的细胞壁组成不同，是用的酶也不同。细菌和放线菌使用溶菌酶来水解细胞壁；真菌使用蜗牛酶、纤维素酶、-葡聚糖酶来水解细胞壁。6-7随着酶浓度的增加，原生质体的生成率提高。然而酶浓度过低，形成率降低，浓度过高，再生率降低。因此，建议使形成率和再生率之积达到最大时的酶浓度为最适浓度。5（5）酶的作用温度、ph和酶解时间 酶的作用温度和ph根据酶和菌种的特性决定。原生质体的形成与酶解时间有关，时间过短，酶解不完全，过长质膜则会收到损伤。因此根据不同菌种的特性来调整。5（6）菌体浓度 酶解时一般先离心收集菌体，然后加入定量酶液。适当的菌浓可以与酶充分接触反应，提高效果。菌体密度一般以3ml酶液中加入300mg新鲜菌体较合适。5（7）酶解方式 植被原生质体时应轻轻摇动或敲击管壁让酶与菌体充分混匀，并保持良好的通气条件。52.2原生质体形成率的测定由于原生质体在低渗的蒸馏水中易破裂，因此，可借用这一特性来进行原生质体形成率的测定。用血球计数板分别计算蒸馏水加入前（用a表示）和蒸馏水加入后（用b表示）的完整细胞数，则原生质体形成率可用下式计算：原生质体形成率=a-ba100%3.原生质体再生原生质体在再生培养基上能重新形成细胞壁，恢复到正常的细胞生活状态。3.1影响原生质体再生的因素 （1）菌体的生理状态和细胞结构 一般上，年轻的菌体比年老的菌体原生质体易于再生。细胞结构不完整的不具备再生的能力，而具有残留细胞壁的比完全酶解细胞壁的容易再生。（2）稳定剂 因为原生质体对渗透压很敏感，因此再生培养基必须是等渗的，其他的与酶解稳定剂相似。5（3）培养基组成 再生培养基的组成对原生质体的再生影响相当明显。在菌体生长培养基中添加适量的营养因子可有效提高再生率，常用的有酵母膏、蛋白质、氨基酸、水解酪蛋白、琥珀酸钠等。此外，二甲亚砜、cacl2、灭活的杆菌或某种菌体细胞壁提取物，也有利于原生质体细胞壁的再生。53.2原生质体再生频率计算原生质体再生频率可以按以下公式计算：再生频率=c-ba-b100%式中，a为总菌落数，即未经处理的菌悬液稀释后涂布于平板长出的菌落；b为未原生质化细胞，即经酶处理后的混合液加蒸馏水稀释，使原生质体破裂，涂布于平板后长出的菌落；c为再生菌落数，即经酶处理后的混合液用高渗溶液稀释，涂布于平板后长出的菌落。4.原生质体融合自然条件下，原生质体发生融合的频率非常低，因此在育种时，一般采用人为诱导的方式进行诱导融合。（1）融合剂 融合剂有化学融合剂和物理融合剂。化学融合剂主要为聚乙二醇（peg），peg以分子桥的形式在两个相邻的原生质体膜间起到中介作用，改变质膜的流动性能，降低表面势能，是膜中镶嵌的蛋白质颗粒凝聚，形成一层易于融合的无蛋白颗粒的磷脂双分子层。在ca2+的存在下，使膜表面电子分布改变，使得接触的质膜形成局部融合，进而凹陷构成原生质桥，作为细胞间通道并扩大，知道全部融合。8放线菌使用分子量为10001500，真菌为40006000，细菌为15006000。常用浓度为30%50%，但随微生物种类不同而异。4-5,9-10物理融合剂有电融合和激光融合。8电融合就是原生质体悬浮液在交流的非均匀电场作用下，受到电介质电泳力的作用，根据双向电泳现象，原生质体向电极的方向泳动。同时，细胞内发生偶极化，原生质体相互粘连，将细胞沿电场线方向排列成串，待到细胞间紧密接触，在外加瞬间高频直流强电压作用，以50s的脉冲冲击原生质体粘连位置，使之发生穿孔，然后原生质体膜复原，相连接的原生质体发生融合。9激光融合是使原生质体紧密贴在一起，再用高功率激光对接触点进行照射，是质膜穿孔进而发生原生质体融合，但操作难度大，应用很少。9（2）无机离子 原生质体融合需要一定量的ca2+和mg2+促进融合，而k+、na+会显著相抵融合率。但无机离子的浓度不宜过高，否则会干扰融合，一般以ca2+ 0.01mol/l、mg2+ 0.02mol/l为宜。5（3）融合时间和温度 由于peg有一定的毒性，处理时间不宜过长，一般为110min。温度对原生质体融合也有一定的影响，细菌和放线菌往往偏低，20为好；真菌30较合适。5（4）细胞浓度 两亲本进行原生质体融合时，需要达到一定的浓度，使得细胞有较大的接触机会，一般要达到107108/ml，这样有助于提高融合频率。5.融合体再生和检出5.1融合体再生融合原生质体的再生包括融合体细胞壁和融合体的再生，细胞壁再生只是原生质体再生的一步。原生质体再生后发育形成菌落，整个过程为复原。复原不仅指原生质体本身长出细胞壁，而且能够繁殖生长，形成菌落。5.2融合体的检出（1）利用营养缺陷型作为遗传标记进行检出 营养缺陷型标记是传统而有效的标记方法。8进行融合的双亲本带有不同的缺陷型标记，不能单独在基本培养基上生长，而融合后形成互补可在基本培养基上生长，因此基本培养基上能够萌发长成菌落的就是融合体。4,7,11（2）利用抗药性作为遗传标记进行检出 不同微生物的抗药性是不同的，是由其遗传物质决定的，因此，不同微生物对某一药物的抗性存在着一定的差异，利用这种差异可以将两亲本和融合体区别出来，进而达到检出的目的。4,7-8,11（3）利用灭活原生质体作为遗传标记进行检出 灭活标记是指在原生质体融合前，使双亲本经紫外线照射、加热或经过某些化学处理，使得双亲丧失在基本培养基上生长的能力，形成灭活标记。8在发生融合后，遗传物质进行互补，能够正常生长。4,7,11（4）利用荧光染色进行检出 在酶解细胞壁时，向溶液中加入荧光色素，是双亲带上不同的荧光标记，而双亲仍能发生原生质体融合。8融合后，在荧光显微镜下，直接挑选出带有双亲荧光标记的融合体即可。7,11（5）利用特殊生理特征进行检出 不同微生物有着独特的生理特征，如固氮能力，将这些生理特征与另一亲本的抗药性或营养缺陷型结合起来可以达到筛选融合体的目的。11（6）利用其他遗传标记进行检出 除了上述遗传标记外，微生物还具有很多其他的遗传标记，如菌落大小、颜色、形状等，根据这些性状，可将亲本和融合体区分开，达到检出的目的。6.原生质体融合育种的应用（1）抗生素高产菌种的选育 原生质体融合可以将两种高产抗生素的微生物融合，使其优点得到叠加，提高抗生素的产量，甚至产生新的抗生素。（2）酵母工程菌的构建 通过将酿酒酵母和其他微生物融合，可以提高酵母菌的酿酒效率，并能使酵母菌利用更多的底物，提高底物利用率和产物生成率。（3）污水处理工程菌的构建 污水处理需要涉及到相当庞大种类的微生物，通过原生质体融合可以将多种菌的功能集中到一种菌上，对微生物的数量进行优化，为其在污水处理上提供了良好的条件。（4）提高代谢产物的质量 在酶制剂生产菌株的选育中，通过原生质体融合，可以提高菌种产酶的活性和耐受性。除以上应用外，原生质体融合育种在改良菌种遗传特性和获得新代谢途径等方面也有着广泛的用途。参考文献:1黄勤妮, 刘佳, 宋秀珍, 杨秀山. 大肠杆菌和枯草芽胞杆菌的原生质体融合. 首都师范大学学报(自然科学版), 2002(1): 5559.2王金盛, 郝德阳, 李春波, 扈雪梅. 棘孢小单胞菌原生质体的融合育种. 山东大学学报(自然科学版), 1999(2): 101105.3黎永学, 张德纯, 李代昆. 双歧杆菌和酿酒酵母原生质体融合子筛选方法的探讨. 食品科学, 2006(2): 8486.4毛雨, 王丹, 黄占斌, 邢建民. 微生物原生质体融合育种技术及其应用. 中国生物工程杂志, 2010(1): 9397.5郑重谊, 谢达平, 谭周进, 肖克宇, 李雨虹. 影响微生物原生质体融合技术的因素. 湖南农业科学, 2006(4): 3538.6孙剑秋, 周东坡. 微生物原生质体技术. 生物学通报, 2002(7): 911.7谭周进, 杨海君, 林曙, 吴铁. 利用原生质体融合技术选育微生物菌种. 核农学报, 2005(1): 7579.8张子栋, 常胜合, 董湘熔, 杨