自噬研究方法工具汇总---BIO-RAD.doc

自噬研究方法工具汇总自噬研究方法工具汇总 BIO RAD 细胞自噬细胞自噬 细胞自噬 autophagy 是依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解的一 种过程 这个过程可以清除功能异常的细胞器 细胞内病原体以及再循环细胞 组分 尽管自噬最早被发现是应答饥饿 现在发现自噬受到各种胁迫信号的诱 导 基础水平的自噬有利于细胞内稳态的维持 很多因素包括激素刺激的天然 免疫信号及能量耗尽或高温等引起的物理胁迫会诱导自噬上调 相反 很多疾 病如癌症 传染性疾病和神经退行性疾病及衰老和自噬的下调都有关联 自噬主要有三种信号通路 自噬主要有三种信号通路 Microautophagy 小自噬通过溶酶体的膜内陷 吞入 目标分子 起到降解细胞质 中小体积物质的作用 这个过程研究得不是很清楚 膜内陷相关的 GTPaseVps1p 蛋白和自噬相关蛋白 Atg 参与其中 分子伴侣介导的自噬 chaperone mediatedautophagy CMA 直接将细胞质蛋白带 到溶酶体 带 KFERQ 序列的蛋白质和热休克蛋白 Hsc70 及其它分子伴侣相互 作用形成的复合体和溶酶体膜上的 Lamp 2A 受体结合后 导致 Lamp 2A 聚合 引发复合体中的底物易位穿越溶酶体膜 Macroautophagy 大自噬被研究得最多 可以降解更大量的胞浆物质 由特殊 的细胞器自噬小体介导 大自噬起始于吞噬泡装配点 PAS 的形成和 Unc51 likekinase Ulk 复合体的组装 这启动了自噬小体的形成 图 1 接着是成核 阶段 Ulk 复合物与由 beclin 1 Vps15 Vps34 Atg14 组成 classIII PI3K 复合 物相互作用形成吞噬泡 接着吞噬泡膜扩展形成自噬小体 在这个过程中 Atg12 5 16 复合物促成了磷脂酰乙醇胺 PE 和 LC3 酵母中是 Atg8 的偶联 这是自噬小体膜唯一已知的标志物 PE LC3 偶联物在几个关键步骤中起作用 自噬泡膜的扩展 自噬体的识别及自噬溶酶体的形成 整个过程涉及 30 多个自 噬相关基因 Atg 蛋白 包括 Beclin 1 溶酶体相关膜蛋白 Lamp 1 and Lamp 2 和微管相关蛋白 1A 1Blight chains 3A B MAP1LC3A B 或简称 LC3 这些都 是自噬常见的标志物 最后一步 完全形成的自噬小体与溶酶体融合释放内含 的物质被降解 自噬细胞信号通路 如何检测自噬 如何检测自噬 Microautophagy 小自噬研究的工具有限 最常用的就是用电子显微镜观察溶 酶体膜内陷形成的囊泡 Chaperone mediated autophagy CMA 被研究得较多 三种分子伴侣 lys Hsc70 膜相关 Hsc70 和 lys Hsp90 有积极参与 作为 CMA 底物受体的膜蛋白 Lamp 2A 的水平可以用来评估 CMA 的活力 Lamp 2A 和 Hsc70 的共定位可以 用来识别 CMA active 溶酶体 另外对于 CMA 底物的评估可参考以下方面 1 KFERQ like targeting motif 是否出现 2 与 lys Hsc70 positive 溶酶体相关联 3 溶酶体活力依赖的降解速度 4 与细胞质 Hsc70 的相互作用 5 与 Lamp 2A 胞内区域相互作用 6 Lamp 2A 活力相关的浓度 7 易位到纯化的溶酶体中的能力 Macroautophagy 大自噬的评估最好使用多个自噬阶段的标志物 因为自噬小 体数量的增加可能是自噬上调也可能是自噬最后阶段被抑制 所以放置合适的 对照能说明得更清楚 1 电子显微镜电子显微镜 透射电镜术 TEM 被广泛用于检测自噬过程中形成的各种结构 从吞噬泡 到自噬小体到自噬溶酶体 但这个技术对使用者操作要求较高 且不能准确定 量 2 检测标志物检测标志物 LC3 Atg8 和和 p62 SQSTM1 微管相关蛋白 1A 1B light chains 3A LC3A 和 3B LC3B MAP1LC3A B 通常简称 LC3 或酵母中称 Atg8 是自噬小体最可靠的标志物 在自噬过程中 非激活型胞质 LC3 LC3 I 经过水解和脂质化后转变为激 活的自噬小体膜结合 LC3 II 通过 Western Blot 可以观察到更小的 LC3 II 条带 或者通过免疫荧光或免疫组化 可观察到 LC3 从胞浆转移到膜结构上 提示 自噬活跃时 LC3 II 的水平也可能低 因为自噬小体与自噬溶酶体融合后 LC3 II 会被降解 另外某些 anti LC3 抗体识别 LC3 I 和 LC3 II 灵敏度上有差异 且 LC3 I 对于反复冻融和降解更敏感即使在 SDS 上样缓冲液中 因此样品要立即 煮沸使用而不要反复冻融 p62 降解是另一个常用的标志物 它在自噬清除多泛素化蛋白时会被优先 降解 自噬过程中 LC3 和 p62 的转录也会被调节 因此除了检测 LC3 和 p62 的 降解 还需加上其它检测 3 检测检测 Lamps Atg5 Atg14 and Beclin 1 针对溶酶体标志物 Lamp 1 和 Lamp 2 或吞噬泡及自噬小体的标志物 Atg5 Atg14 Beclin 1 的抗体经常被用在免疫荧光显微镜上 western blot 及流式 细胞仪上追踪自噬过程的进展 Lamp 2 的检测应该与 LC3 II 检测联用 因 Atg14 也与 ER 关联它的检测也需要与其它标志物检测联用 4 组织蛋白酶组织蛋白酶 Cathepsin 活力检测活力检测 荧光标记的组织蛋白酶底物可通过报告 cathepsin B K L 的蛋白酶活力来 发现活细胞中的溶酶体 这些可渗透细胞的无毒的试剂加入到细胞中被 cathepsin 降解后产生荧光物质 与细胞核染料如 Hoechst 及溶酶体和细胞器标 志物如 acridine orange 联用 可检测自噬水平 这些检测方法兼容荧光显微镜 和酶标仪 5 检测自噬潮检测自噬潮 autophagic flux 因为自噬是一个动态的过程 自噬潮是一个动态连续的概念 涵盖了自噬 体的形成 自噬性底