鼠尾草黄酮对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究.docx

鼠尾草黄酮对-淀粉酶和-葡萄糖苷酶抑制作用的研究Behvar Asgharia,b*, Peyman Salehib, Ali Sonbolic, Samad Nejad Ebrahimib,d摘要人们认为抑制碳水化合物水解酶的活性，包括-淀粉酶和-葡萄糖苷酶，是降低餐后血糖水平的治疗方法之一，特别是治疗2型糖尿病患者。药用植物及其他们提取物是找到新的酶抑制剂的主要来源之一。我们从鼠尾草的地上部分分离得到四种黄酮类化合物, 即木犀草素-7-O-葡萄糖苷(1)，木犀草素-7-O-葡萄糖苷酸(2)，香叶木素-7-O-葡萄糖苷酸(3)和三裂鼠尾草素(4)。通过-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的抑酶试验对这些化合物的活性进行了评估。化合物1、2和3表现出明显的-葡萄糖苷酶的抑制作用，其IC50值分别为18.3，14.7，17.1M。这些化合物也表现出适度的的-淀粉酶的抑制作用，其IC50值分别为81.7，61.5，和76.3M。关键词：鼠尾草；-淀粉酶；-葡萄糖苷酶；酶抑制作用；黄酮类化合物前言糖尿病是全球新兴的一个健康问题。最近调查评估说明了一个严峻的现实,到2050年将有三分之一的人口患有糖尿病(1)。1型糖尿病(胰岛素依赖型)和2型糖尿病(非胰岛素依赖型)是糖尿病主要的两种类型。全世90%的糖尿病患者属于2型糖尿病患者，主要是因体重增加和缺乏锻炼导致的。已有研究表明，2型糖尿病表现为餐后血糖水平异常升高。因此，控制餐后血糖水平是治疗2型糖尿病的一个重要因素，-淀粉酶和-葡萄糖苷酶是催化复杂碳水化合物糖苷键断裂的关键酶，如催化淀粉糖苷键断裂释放可吸收的葡萄糖。-淀粉酶是胰腺分泌的主要产物之一，约占5 - 6%，它催化淀粉水解为较短的寡糖(3)。-淀粉酶的蛋白质结构包含3个结构域：A，B和C。催化三联体(Asp197，Glu233和Asp300)位于结构域A。淀粉的水解过程就是一个双取代反应过程，酸催化形成-D-吡葡亚硝脲-酶中间复合物，接着碱催化水解中间复合物。Asp197作为亲核中心进攻位于糖异头物中心的底物， Glu233和Asp300起到酸催化或碱催化的作用，要么单独作用要么两者协同作用(4)。-葡萄糖苷酶是催化非还原性末端以1,4-糖苷键链接的葡萄糖残基释放出游离的葡萄糖分子。研究表明氨基酸残基Trp516和Asp518是酶催化功能的关键(5)。抑制-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的活性可以延缓葡萄糖的释放，有效控制餐后血糖水平。-淀粉酶和-葡萄糖苷酶抑制剂目前已有临床应用，如阿卡波糖和米格列醇，会产生严重的副作用。越来越多的报道揭露了这些制剂的抗药性(6)。为了克服这些问题，寻找新的-淀粉酶和-葡萄糖苷酶抑制剂，特别是从天然产物来源中寻找有效的抑制剂正在进行着且被推崇(7)。鼠尾草是世界遍布最广的唇形科植物，包含900多个物种，特别是在温带和较暖的地区(8)。在伊朗，鼠尾草有58个种，其中有17个物种是地方性的(9)。鼠尾草精油及其提取物具有多种生物活性，包括抗氧化，抗菌，抗真菌，抗肿瘤，抗炎，抗胆碱酯酶，抗原生动物和抗糖尿病 (8，10)。在伊朗的民间，鼠尾草有用于治疗糖尿病 (11)。也有报道关于鼠尾草有抑制-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的作用。研究表明S.acetabulosa的不同提取物具有抑制-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的作用。其中，总酚含量高的甲醇提取物对两种酶均有很好的抑制作用(12)。从S.moorcraftiama的丙酮粗提物中分离得到的5-hydroxy-7,4-dimethoxyflavone和齐墩果酸是两种有效-葡萄糖苷酶抑制剂 (13)。Ma等对S.miltiorrhiza的酶抑制作用进行了评估，并从75%的乙醇提取物中分离得到16种活性化合物 (14)。在另一项研究Nickavar Abolhasani的报道中谈到，从Salvia virgata的醇提物中分离出的黄酮，金圣草素对-淀粉酶具有良好的抑制效果 (15)。有人研究了伊朗当地植物S.chloroleuca精油的化学成分及抗菌活性(16)。本文报道了S.chlorolueca提取物对-淀粉酶和-葡萄糖苷酶活性的影响以及通过生物测定引导分馏过程分离和鉴定其有效成分。首次对S.chlorolueca的化学成分及其对-淀粉酶和-葡萄糖苷酶抑制能力进行了研究。实验试剂猪胰腺-淀粉酶 VI型(EC )，面包酵母-葡萄糖苷酶I型 (EC 0)。3,5-二硝基水杨酸(DNS)，p-硝基苯-D-葡萄糖苷(PNPG)，麦芽糖和阿卡波糖(Sigma-Aldrich，巴黎，法国 )。可溶性淀粉、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、酒石酸钾钠和氯化钠(默克公司)。分析级萃取溶剂和高效液相色谱级溶剂 (巴塞罗那，西班牙)。液相色谱级水：EASY-pure II水净化系统(Barnstead, Dubuque IA, USA)。氘溶剂(Armar化学品，Dottingen，瑞士)。仪器 分析型高效液相色谱分离系统：1100系列组成的二元高压混合泵与脱气器模块、柱温箱和1100系列PDA探测器(安捷伦，Waldbronn，德国)。吉尔松215液体处理器，吉尔松 819注入模块和50L自动进样环。高效液相色谱-质谱联用系统：3000 +离子阱质谱仪，电喷射(ESI) (Bruker Daltonics，Bremen，德国)。使用HyStar 3.0执行数据采集和处理软件(Bruker Daltonics)。半制备高效液相色谱分离系统：安捷伦 1100系列四元低压混合泵和脱气器模块,柱温箱，1100系列PDA探测器和1000L自动进样环。制备型高效液相色谱系统： SCL-10VP控制器和二进制泵(LC-8A)，紫外可见SPD-M10A VP探测器和Class-VP 6.12软件(日本岛津公司)。Avance III光谱仪：500 MHz1H和125 MHz13C (Bruker Biospin，Fallanden，瑞士)。1毫米TXI探针，数据处理：Topspin 2.1(Bruker)。抑酶试验的混合物吸光度测定：酶标仪（BioTek）。植物原料S.chloroleuca的地上部分，原料于2008年6月采摘于从海拔2300米的Shahrestanak（位于伊朗的德黑兰市）。植物学博士Dr. Ali Sonboli（药用植物与药物研究所生物系，Shahid Beheshti University，德黑兰，伊朗）对原料植物做出生物学鉴定。凭证标本(MPH 845)放置在药用植物与药物研究所，Shahid Beheshti University，德黑兰，伊朗。提取和分离取干燥的叶子100g，用ZM 1超速离心粉碎机（Retsch，Haan， 德国）粉碎后过直径为0.75mm的筛网，连续用正己烷，乙酸乙酯，甲醇浸提，溶剂用量各为2L。提取液减压浓缩至干燥状态，得到了20g的甲醇提取物。将甲醇提取物用蒸馏水溶解制成悬浮液，加到Diaion HP-20(540 cm)层析柱中。用水洗脱后，再用3 L甲醇洗脱，收集到一小部分富含酚类化合物的片段（8.1 g）。这一部分再过sephadex LH-20 (250 cm)层析柱，用甲醇洗脱。TLC法鉴别合并相似组分,最终产生了5个片段(F1-F5)。这5个片段都做了-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的抑制实验。活性最强的片段通过制备型高效液相色谱分离纯化，色谱柱：SunFire C18，5 m，150 30 mm，Waters；流动相：10-100 % 的甲醇，0.1 %的乙酸水；流速：20 mL/min；时间：40 min；进样量：200 L。收集得到的峰再经半制备型高效液相色谱分离纯化，色谱柱：SunFire C18，5 m，150 10 mm，Waters；流动相：10-100 % 的甲醇，0.1 %的乙酸水；流速：4 mL/min；时间：40 min。从F3中得到化合物1 (8 mg)，化合物2 (5 mg)，从F4 中得到化合物3 (6 mg)。正己烷提取物通过硅胶柱层析分离纯化，洗脱剂为正己烷-乙酸乙酯混合物。收集到的40%乙酸乙酯洗脱部分(250 mg)经半制备高效液相色谱分离纯化，最终产生了已知的化合物4，即三裂鼠尾草素20 mg。四种化合物的具体分离纯化过程用流程图表示，见图1。木犀草素-7-O-葡萄糖苷(1)1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 3.16-3.46 (m, sugar-H), 3.69(d, J = 11.0 Hz, H-5), 5.02 (d, J = 7.4 Hz, H-1), 6.41 (d, J = 2.0 Hz, H-6), 6.67 (s, H-3), 6.74 (d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.87 (d, J = 8.3 Hz, H-5), 7.37-7.40 (m, H-2,6). UV max 254 nm, 350 nm. MS (m/z) 447.1 M-H-.木犀草素-7-O-葡萄糖甘酸(2)1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 3.28-3.51 (m, sugar-H), 3.98 (d, J = 9.3 Hz, H-5), 5.23 (d, J = 7.2 Hz, H-1), 6.45 (d, J = 2.0 Hz, H-6), 6.70 (s, H-3), 6.79 (d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.91 (d, J = 8.5 Hz, H-5), 7.40-7.45 (br s, H-2, 6). UV max 254 nm, 350 nm. MS (m/z) 461.1 M-H-.香叶木素-7-O-葡萄糖苷酸(3)1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 3.33-3.45 (m, sugar-H), 3.90 (s, OMe-4), 4.02 (d, J = 9.6 Hz, H-5), 5.25 (d, J = 7.3 Hz, H-1), 6.47 (d, J = 2.0 Hz, H-6), 6.86 (d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.93 (s, H-3), 6.95 (d, J = 8.3 Hz, H-5), 7.55-7.40 (m, H-2, 6). UV max 268 nm, 345 nm. MS (m/z) 475.1 M-H-.三裂鼠尾草素(4)1H NMR (500 MHz, CDCl3) 3.89 (s, OMe-4), 3.92 (s, OMe-7), 3.96 (s, OMe-6), 6.54 (s, H-8), 6.58 (s, H-3), 7.02 (d, J = 9.0 Hz, H-3, 5), 7.84 (d, J = 9.0 Hz, H-2, 6). UV max 274 nm, 330 nm. MS (m/z) 329.1 M+H+.图1 从鼠尾草甲醇提取物分离纯化-淀粉酶和-葡萄糖苷酶抑制剂(化合物1 - 3) 方案图2 分离化合物的化学结构式-淀粉酶抑制试验 -淀粉酶抑制活力参考文献(17)的方法进行测定，并在原有的基础上稍加改变。试验在96 孔板中进行，各组分的总体积为250L：100 mM磷酸盐缓冲溶液(pH 6.8)，17 mM氯化钠,可溶性淀粉1.5 mg，50L抑制剂（DMSO溶解，浓度分别为12.5，25，50，100和150 M)），10 L的酶液（25 U/mL）。37孵育30 min后，加入20 L氢氧化钠溶液(2N)和20 L显色剂(3,5-二硝基水杨酸溶液4.4 M， 酒石酸钾钠溶液106 M ， 氢氧化钠溶液40 M)， 100 C水浴孵育20 min。由于反应中会有麦芽糖产生，在显色剂的作用下显色后于540 nm的波长下有最大吸收。-淀粉酶的活力可在540 nm的波长下测定混合物的吸光度即可测出，空白组用缓冲液代替酶液加入，其他不变，如下：样品吸光度校正=样品的吸光度空白组的吸光度获得净吸光度，根据麦芽糖标准校准曲线计算麦芽糖的生成量 (w/v)。阳性对照组（100%的酶活力），不添加DMSO溶解的植物提取物。-淀粉酶的抑制率通过以下公式计算：反应率%=样品组中的麦芽糖含量阳性对照组中的麦芽糖含量100-淀粉酶的抑制率%=100反应率%-葡萄糖苷酶的抑制试验-葡萄糖苷酶活力参考文献（18）的方法进行测定。反应在96孔板中进行，形成混体系，37孵育15 min。混合体系中含有20 L-葡萄糖苷酶(0.5U/mL)，120 L 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.9)和10 L不同浓度测试样本(浓度分别为5、10、15、30、50M)。孵育结束后，加入20 L的5 mM的PNPG溶液（用0.1 M的磷酸盐缓冲溶液溶解），继续在37下孵育15 min。加入80 L的0.2 M碳酸钠溶液停止反应。然后用酶标仪在波长为405 nm下测定其吸光度。反应体系中不加植物提取物的作为阳性对照组，不添加-葡萄糖苷酶的作为空白对照组。样品对-葡萄糖苷酶的抑制率通过以下公式计算可得：-葡萄糖苷酶的抑制率%=阳性对照组的吸光度-样品组的吸光度阳性对照组的吸光度100表1 鼠尾草提取物对-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的抑制作用鼠尾草提取物-淀粉酶(IC50g/mL)-葡萄糖苷酶(IC50g/mL)正己烷57.0 1.226.2 3.2乙酸乙酯62.2 3.437.9 2.7甲醇39.8 1.913.3 1.3表2 分离化合物对-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的抑制作用化合物-淀粉酶(IC50M)-葡萄糖苷酶(IC50M)（1）81.7 2.3*18.3 1.7（2）61.5 1.414.7 2.1（3）76.3 0.6*17.1 1.9（4）10050阿卡波糖53.4 3.116.1 0.8每组数据表示为：平均值SD，数据显著性与阿卡波糖比较（*p0.05为显著性差异）数据分析数据采用 Graphpad Prism version 5.00处理分析，差异性采用Turkey法处理分析，p0.05为显著性差异。所有的试验均做三次平行，试验数据结果表示为平均值SD。IC50值根据标准曲线计算得到，即反应体系中酶抑制率为50%时样品的浓度。结果与分析我们也测定了鼠尾草的正己烷，乙酸乙酯，甲醇提取物对-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的抑制作用，测定结果在表1中显示。其中甲醇提取物对两种酶的抑制作用最强，IC50值分别为39.8和13.3 g/mL。正己烷提取物也表现出了较强的-葡萄糖苷酶的抑制作用，IC50值为26.2 g/mL。粗提物的高活性促使我们去发现其中所含的活性化物。通过生化试验引导分离得到甲醇提取物中的3种活性化合物：木犀草素-7-O-葡萄糖苷(1)，木犀草素-7-O-葡萄糖苷酸(2)，香叶木素-7-O-葡萄糖苷酸(3)，而三裂鼠尾草素(4)是从正己烷中分离得到的主要活性化合物。分离得到的化合物经ESI-MS，1D 和 2D NMR进行结构鉴定，并与已知的数据(19-22)比对。四种化合物的化学结构如图2所示。进一步测定分离得到的四种化合物对-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的抑制作用，结果见表2。化合物1，2，3对-淀粉酶均有适中的抑制作用，IC50值分别为81.7 M (1)， 61.5 M (2)，和76.3 M(3)，阿卡波糖对-淀粉酶的IC50值为53.4 M。在所有的化合物中，化合物2表现出了对-葡萄糖苷酶极其高效的抑制作用，其IC50值为14.7 M，而阿卡波糖