仪器分析第4讲 高效液相色谱法.ppt

第三章高效液相色谱分析HighPerformanceLiquidChromatography HPLC 希腊语chroma 色彩 graphos 图谱 俄语 德语Chromatographie英语Chromatography 液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术 3 1高效液相色谱法的特点 1 高效液相色谱法概述 1960年代 由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性 为了分离蛋白质 核酸等不易汽化的大分子物质 气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱 1960年代末科克兰 哈伯 荷瓦斯 莆黑斯 里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪 开启了高效液相色谱的时代 1971年科克兰等人出版了 液相色谱的现代实践 一书 标志着高效液相色谱法 HPLC 正式建立 它是在经典液相色谱基础上 引入了气相色谱的理论 在技术上采用了高压泵 高效固定相和高灵敏度检测器 因而具备速度快 效率高 灵敏度高 操作自动化的特点 为了更好地了解高效液相色谱法优越性 现从两方面进行比较 一 概述 1 高效液相色谱法与经典液相色谱法 高效液相色谱法的最大优点在于高速 高效 高灵敏度 高自动化 液体的流动相高速通过时 受到的阻力较大 为了能迅速通过色谱柱 必须对流动相施加高压15 35Mpa 因此高压 高速是高效液相色谱的特点之一 高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较 2 高效液相色谱法与气相色谱法 l 气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物 它们仅占有机物总数的20 对于占有机物总数近80 的那些高沸点 热稳定性差 摩尔质量大的物质 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析 2 高效GC1000塔板 m 填充柱 HPLC3W塔板 m 3 气相色谱一般都在较高温度下进行的 而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作 总之 高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点 并用现代化手段加以改进 因此得到迅猛的发展 高效液相色谱与气相色谱的比较 液相色谱仪器highperformanceliquidchromatograph 3 高效液相色谱法的应用 1 药物分析约80 的药物都能用高效液相色谱进行分离和纯化 特别是手性药物的分离分析 2 食品分析 食品本身组成 特别是营养成分 如糖 有机酸 维生素 蛋白质 氨基酸 脂肪的分析 食品添加剂 如防腐剂 抗氧化剂 合成色素 甜味剂和保鲜化学物质的分析 食品污染物 如农药残余和黄曲霉素等的分析 3 制备分离应用要制备或提取一些高纯化合物 如新合成化合物的结构鉴定 药物的生物和毒理试验 4 高效液相色谱法的特点 高压 150 105 350 105Pa 高速 in1hr 高效 3w m 高灵敏度 UV ng FL 10pg TAS 人参 西洋参与三七的鉴别 三种药材的HPLC指纹图谱 3 2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 H A B C 高效液相色谱中的速率方程 高效液相色谱中的速率方程涡流扩散项纵向扩散流动相传质滞留区传质固定相内传质 2 对速率方程的讨论 选用细颗粒填料可获高柱效 5 m 流动相流速低 有利于达到高柱效选用黏度小的流动相有利于提高柱效温度的影响 适当提高柱温以降低流动相黏度 液膜厚度的影响 3 柱外效应 由于色谱柱之外的因素引起的色谱峰的展宽 例如进样系统 连接管路及检测器的死体积等 3 3高效液相色谱的类型及其分离原理 液 液分配色谱及化学键合相色谱液 固吸附色谱离子交换色谱离子色谱空间排阻色谱 流动相和固定相都是液体 分离原理 利用组分在两相中溶解度的差异固定相 载体 固定液早期物理或机械法涂渍固定液 由于易流失已较少采用 现在应用最广的是化学键合固定相 将各种不同基团通过化学反应键合到担体 硅胶 表面的游离羟基上 liquid liquidpartitionchromatography 1 液 液分配色谱 液 液分配色谱 固定液类型 氧二丙腈 聚乙二醇 角鲨烷等 液 液色谱流动相应尽可能不与固定液互溶 两者的极性差别应很大 固定液为极性 流动相为非极性的液 液色谱称为正相色谱 反之 则称为反相色谱 正相色谱 固定液极性 流动相极性 NLLC 极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱适于分离极性组分反相色谱 固定液极性 流动相极性 RLLC 极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱适于分离非极性组分 液液分配色谱法 液 液分配色谱 应用 液 液色谱能分离多种类型化合物 如烷烃 烯烃 芳烃 染料 甾族化合物等 利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面 1 分离原理 分配 吸附 以LLC为基础 2 特点 不易流失热稳定性好化学性能好载样量大适于梯度洗脱 化学键合固定相 chemicallybondedphasechromatography 分离原理 利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异 分离前提 K不等或k不等 流动相为液体 固定相为固体吸附剂 2 液 固吸附色谱liquid solidadsorptionchromatography 液 固吸附色谱 固体吸附剂主要类型 极性的硅胶 应用最广 氧化铝分子筛非极性的活性炭 液 固吸附色谱 应用 分离极性不同的试样分离含极性基团相同但数目不同的试样分离异构体 3 离子交换色谱ion exchangechromatography 固定相 阴离子或阳离子交换树脂 流动相 阴离子交换树脂作固定相 采用酸性水溶液 阳离子离子交换树脂作固定相 采用碱性水溶液 基本原理 组分在固定相上发生的反复离子交换反应 组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径 电荷 存在形式等有关 亲和力大 保留时间长 阳离子交换 R SO3H M R SO3M H 阴离子交换 R NR4OH X R NR4X OH 应用 离子及可离解的化合物 包括氨基酸 核酸等 离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法 由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制 例如 对于那些不能采用紫外检测器的被测离子 如采用电导检测器 由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测 为了解决这一问题 1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术 4 离子色谱ionchromatography 离子色谱 应用 待测阴离子随流动相通过离子交换树脂时发生离子交换反应 至今离子色谱是分离分析常见无机混合阴离子的最佳分析方法 5 空间排阻色谱 凝胶色谱 size exclusionchromatography 固定相 凝胶gel具有一定大小孔隙分布 原理 按分子大小分离 小分子可以扩散到凝胶空隙 由其中通过 出峰最慢 中等分子只能通过部分凝胶空隙 中速通过 而大分子被排斥在外 出峰最快 溶剂分子非常小 故在最后出峰 整个试样都在tM 死时间 之前出峰 空间排阻色谱法 特点 峰扩展比较小流动相和固定相的选择比较简单不能分离异构体 10 可对相对分子质量在100 8 105范围内的化合物按质量分离 液相色谱分离类型的选择 1 根据相对分子质量选择相对分子质量十分低的样品 其挥发性好 适用于气相色谱 标准液相色谱类型 液 固 液 液 及离子交换色谱 最适合的相对分子质量范围是200 2000 对于相对分子质量大于2000的样品 则用尺寸排阻法为最佳 2 根据溶解度选择如 样品可溶于水并属于能离解物质 以采用离子交换色谱为佳 如 样品可溶于烃类 如苯或异辛烷 则可采用液 固吸附色谱 3 根据分子结构选择例如 酸 碱化合物宜用离子交换色谱 脂肪族或芳香族宜用液 液分配色谱或液 固吸附色谱 异构体用液 固吸附色谱 同系物用液 液分配色谱 等等 分离类型选择总结 P93 3 4液相色谱法固定相 高效液相色谱柱是HPLC的心脏 左右心房分别是 固定相和其填装技术 固定相高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类 可分为刚性固体和硬胶两大类 刚性固体以二氧化硅为基质 可承受7 O 108 1 O 109Pa的高压 可制成直径 形状 孔隙度不同的颗粒 2 全多孔型由氧化硅 氧化铝 硅藻土等制成的多孔球体 早期采用100 m的大颗粒 表面涂渍固定液 性能不佳已不多见 现采用5 10 m的小颗粒 比表面积和柱容量都很大 1 表面多孔型基体是30 40 m实心玻璃微球 表面附着一层厚度为1 2 m的多孔活性材料 如硅胶 氧化铝等 表面积小 柱容量低 固定相按照空隙深度分类 1 液液色谱法 键合相色谱法及离子对色谱法固定相1 全多孔型单体 porousmicrobeadssupport 2 表层多孔型担体 pellicularmicrobeadssupport 化学键合固定相 1960后 在硅胶表面利用硅烷化反应制得Si O Si C型的反应该化学键稳定 是广泛使用的固定相 C 18 常用固定相表3 2 化学键合固定相特点 表面没有液坑 传质快无固定液流失可以改变选择性 通过键合不同官能团 有利于梯度洗提 及配用灵敏的检测器 2 液固吸附色谱法固定相 2 高分子多孔小球 YSG原理 吸附 分配蒹小孔凝胶作用特点 柱选择性好 峰形好 柱效低适用 分离弱极性化合物 在气相色谱中 载气是惰性的 常用的只有三四种 他们的性质差异也不大 所以要提高柱子的选择性 只要选择合适的固定相即可 但在液相色谱中 当固定相选定后 流动相的种类 配比能显著的影响分离效果 因此 流动相的选择也非常重要 液相色谱的流动相又称为 淋洗液 洗脱剂 3 5液相色谱法流动相 流动相的选择原则 流动相纯度要高 色谱纯 且价格便宜应避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样要有适宜的溶解度溶剂的粘度要小些为好应与检测器相匹配 常用溶剂的极性顺序 水 最大 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷 氯仿 溴乙烷 苯 四氯化碳 二硫化碳 环己烷 己烷 煤油 最小 在选择溶剂时 溶剂的极性是选择的重要依据 例如 采用正相液 液分配分离时 首先选择中等极性溶剂 若组分的保留时间太短 降低溶剂极性 反之增加 也可在低极性溶剂中 逐渐增加其中的极性溶剂 使保留时间缩短 在选择溶剂时 溶剂的极性是选择的重要依据 高效液相色谱仪 3 6高效液相色谱仪 高效液相色谱仪 贮液器 高压泵 梯度洗提装置 进样器 色谱柱 检测器 恒温器和色谱工作站等 主要工作部件 1 高压泵 色谱柱很细1 6mm 填充剂粒度小5 10 m 阻力很大要求 流量稳定 压力平稳无脉动 1 往复式柱塞泵 2 气动放大泵 恒流泵和恒压泵两类 2 梯度洗提 梯度洗提即程序控制流动相的组成 使在整个分离过程中 溶剂强度按照特定的变化规律增加 优点 分离复杂混合物 使所有组分都处在最佳的k值范围内 缺点 检测器的使用受到限制 分析结果的重复性取决于流速的稳定性 柱子需进行再生处理 应用举例 3 进样装置 注射器进样装置高压定量进样阀 旋转式六通阀 六通进样阀结构示意图 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多 约5 30cm 所以柱外展宽 又称柱外效应 较突出 进样系统是引起往前展宽的主要因素 因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严 进样阀 色谱柱是液相色谱仪的心脏部件 它包括柱管与固定相两部分 柱管材料有玻璃 不锈钢 铝 铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属 玻璃管耐压有限 故金属管用得较多 目前标准色谱柱长15 30cm 内径为4 6mm或3 9mm 直型不锈钢柱 4 分离系统 色谱柱 柱子装填得好坏对柱效影响很大 对于细粒度的填料 20 m 一般采用匀浆填充法装柱 先将填料调成匀浆 然后在高压泵作用下 快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内 经冲洗后 即可备用 液相色谱柱发展趋势 减小填料颗粒度 3 5 m 提高柱效 可以使用更短的柱 数cm 加快分析速度 减小柱径 内径 1mm 降低溶剂用量又提高检测浓度 5 检测器 紫外检测器荧光检测器示差折光检测器电导检测器 5 检测系统 在液相色谱中 有两种基本类型的检测器 一类是溶质性检测器 它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应 属于这类检测器的有紫外 荧光 电化学检测器等 另一类是总体检测器 它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应 属于这类检测器的有示差折光 电导检测器等 理想的检测器特性 灵敏度高重现性好响应快线性范围宽适用范围广对流动相流量和温度波动不敏感死体积小 1 紫外 可见检测器 应用最广 适用于对紫外可见光有吸收的样品的检测 对大部分有机化合物有响应 其结构同紫外 可见分光光度计 现将常用的检测器介绍如下 紫外检测器 应用最广 对大部分有机化合物有响应 响应特性 选择性检测器 如芳烃类化合物的检测灵敏度高 可检测10 9g mL的物质线性范围宽 104 105对温度及流动相的改变不敏感适合梯度洗提HPLC常规检测器 示差折光检测器 示差折光检测器是依据不同性质的溶液对光具有不同的折射率 通过连续测量溶液折射率的变化 便可测知各组分的含量 示差折光检测器 differentialrefractiveindexdetector 除紫外检测器之外应用最多的检测器 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值 差值与浓度呈正比 通用型检测器 每种物质具有不同的折光指数 灵敏度低 对温度敏感 不能用于梯度洗脱 偏转式 反射式和干涉型三种 响应特性 通用型的浓度检测器低灵敏度 10 7g mL 基线易受温度的影响 温度精密度 10 3 不适合梯度洗提 荧光检测器 fluorescencedetector 根据某些物质受激后能产生一定强度荧光的性质 可制成灵敏度极高的荧光检测器 响应特性 选择性检测器 对多环芳烃 维生素B 黄曲霉素 卟啉类化合物 农药 药物 氨基酸 甾类化合物等有响应 高灵敏度 比紫外高约1000倍适合梯度洗提 荧光检测器 结构 应用举例 电导检测器 结构 离子色谱法中使用最广的检测器 原理 根据物质在某些介质中解离后所产生的电导变化来进行测定 响应特性 选择性检测器 对离子型化合物有响应灵敏度高受温度的影响不能梯度洗提 3 7HPLC分离类型的选择 选择合适的液相色谱分离类型了解分析对象要分析的组分的大致浓度干扰物质试样的性质化学结构分子量极性 酸碱性溶解度参数 色谱分离方式的选择 根据相对分子质量选择根据溶解性选择根据分子结构选择 根据相对分子质量选择 相对分子质量低的试样 400 因其挥发性强 宜采用气相色谱分离 相对分子质量大于2000的化合物可采用液相色谱分离 相对分子质量介于400 2000范围内的分子 应视试样性质选用液 固吸附色谱 液 液分配色谱或离子交换色谱分离 根据分子结构选择 液 固吸附色谱适用于异构体分离 液 液分配色谱可用于同系物分离 含有离子基团和能电离基团的组分 可采用离子交换色谱分离 生物大分子或高分子聚合物可用空间排阻 凝胶 色谱分离 根据溶解性选择 水溶性离子化合物与共价化合物可分别采用离子交换色谱或液 液分配色谱分离 对于非水溶性化合物 若易溶于烃类溶剂 可采用液 固吸附色谱分离 若溶于二氯甲烷或氯仿 可采用液 固吸附色谱或正相液 液分配色谱分离 若溶于甲醇 则用反相液 液分配色谱分离 溶于水 排阻色谱 水为流动相相对分子质量 2000不溶于水 排阻色谱 非水流动相同系物 键合相色谱不溶于水异构体 液固色谱样品分子大小差异 排阻色谱反相键合相色谱相对分子质量溶于水 不离解 2000排阻色谱 水为流动相碱 阳离子色谱溶于水 可离解酸 阴离子色谱溶于水 离子与非离子 反相离子对色谱 选择合适的分析条件色谱柱流动相检测器的种类及条件 波长等 样品的预处理方法 高效液相色谱仪应用实例 气相色谱法与高效液相色谱法的比较 气相色谱法虽具有分离能力好 灵敏度高 分析速度快 操作方便等优点 但是受技术条件的限制 沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析 高效液相色谱仪应用实例 高效液相色谱法 只要求试样能制成溶液 而不需要气化 因此不受试样挥发性的限制 对于高沸点 热稳定性差 相对分子量大 大于400 的有机物原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离 分析 这些物质几乎占有机物总数的75 80 3 8HPLC的应用 ApplicationofHPLC 1 环境中有机氯农药残留量分析固定相 薄壳型硅胶 37 50 m 流动相 正己烷流速 1