课题3卵泡闭锁的分子调控年度总结报告.doc

课题3：卵泡闭锁的分子调控年度总结报告刘红林（南京农业大学）本文档由【中文word文档库】提供，转载分发敬请保留本信息；中文word文档库免费提供海量范文、教育、学习、政策、报告和经济类word文档。一、 年度计划执行情况1. 年度计划完成情况；一年来，我们围绕卵泡发育和闭锁分子机理与调控的主题开展有关基础理论研究，在microRNAs通过抑制靶基因的表达促进猪卵泡颗粒细胞凋亡、FOXO1参与氧化应激引起的小鼠卵泡颗粒细胞凋亡、VEGF、FSH等对卵泡血管发育以及卵泡发育与闭锁的影响、卵母细胞中敲除GGPPs基因对小鼠生殖性能的影响、束缚应激对卵母细胞细胞发育能力影响的机理、葡萄糖代谢及药物对卵母细胞老化的调控以及促性腺激素调控卵母细胞减数分裂的信号通路研究以及全基因组关联研究定位多囊卵巢综合征易感基因位点等方面取得一些进展。发表标注2007CB947403资助的SCI论文10篇，有正高6人，副高3人，中初4人，博士后3人，博士生11人，硕士生9人参与研究工作。现将完成的主要工作汇报如下：2. 研究工作的主要进展；（1）miR-26b通过抑制靶基因ATM的表达促进猪卵泡颗粒细胞凋亡目前已知的猪miRNA数量较少，课题组利用生物信息学方法，将猪的EST序列与人和小鼠的miRNA进行比对，再通过进一步的筛选，在猪上成功预测了98种新miRNA。利用ParafloTM microRNA微阵列基因表达技术建立了卵泡闭锁过程中miRNA表达谱，比较分析了健康卵泡、轻度闭锁卵泡、重度闭锁卵泡的miRNA表达差异，筛选到数24种在猪卵泡闭锁启动过程中表达活性显著变化的miRNA,其中表达上升的11种，表达下降的13种，部分是课题组新预测的miRNA。对于筛选得到的24种差异表达的miRNA，进一步预测其靶基因，并对靶基因进行GO及Pathway分析，从而发现其中6种miRNA的主要生物学作用集中在细胞增殖、细胞分裂、细胞凋亡、DNA复制、细胞粘附、蛋白质向核内的运输等方面，这6种miRNA分布于let-7家族（let-7a、let-7b、let-7c、let-7g、let-7i、）和miR-26b，从中我们重点选择了miR-26b进行下一步研究。卵泡闭锁起因于颗粒细胞的凋亡，所以课题组着重研究了miR-26b调控颗粒细胞凋亡的机制。体外培养猪卵巢颗粒细胞，转染miR-26b mimic，通过流式细胞仪检测发现miR-26b确实能在体外诱导颗粒细胞凋亡；在预测的miR-26b靶基因中，我们发现了DNA损伤的上游效应蛋白ATM，ATM主要调控DNA损伤修复和细胞周期。Real-time PCR检测发现，颗粒细在转染miR-26b后ATM表达量下降。为了进一步探索miR-26b与ATM之间的关系，我们将ATM序列中miR-26b的结合位点连接到荧光素酶基因的3-UTR区，通过荧光素酶活性检测证实了ATM是miR-26b直接靶基因；为了检测转染miR-26b后颗粒细胞DNA损伤情况，我们采用TUNEL染色结合流式细胞仪证实转染miR-26b后颗粒细胞DNA损伤显著增加。综合以上结果，我们推测卵泡闭锁过程中miR-26b表达上升，从而抑制ATM基因的表达，继而影响DNA损伤修复，导致颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁。（2）FOXO1参与氧化应激引起的小鼠卵泡颗粒细胞凋亡采用双氧水处理体外培养的小鼠卵泡颗粒细胞，建立体外氧化应激模型。试验发现氧化应激导致的颗粒细胞凋亡具有双氧水浓度依赖性，TUNEL染色发现颗粒细胞凋亡随双氧水浓度的升高显著增加，Real-time RCR检测表明凋亡标志基因Caspase 3的表达量在氧化应激后显著增加；为了研究Foxo1是否参与氧化应激过程，我们检测了Foxo1及其下游调控基因（Bim、TRAIL、FasL）的表达，结果发现氧化应激后Foxo1其下游调控基因Bim、TRAIL、FasL的mRNA表达量均显著增加,Western结果显示氧化应激后Foxo1的蛋白水平也显著增加；为了进一步验证Foxo1参与氧化应激过程，我们筛选了高效抑制Foxo1基因的siRNA，在Foxo1干涉后，氧化应激诱导的颗粒细胞凋亡显著下降，且Bim、TRAIL、FasL、Caspase 3基因表达量也显著下降；免疫荧光染色发现，氧化应激导致Foxo1蛋白入核增加，干涉后，核内的Foxo1减少。该研究表明，氧化应激在转录和翻译水平促进了Foxo1基因的表达，并增加该蛋白入核，从而激活下游凋亡相关基因的表达，进而诱导颗粒细胞凋亡。（3）VEGF、FSH等对卵泡血管发育以及卵泡发育与闭锁的影响采用活体腹腔注射法探讨血管发育影响因子血管内皮生长因子（VEGF）、雌激素E2（17-estradiol）、促卵泡激素（FSH）、2-甲氧基雌二醇（2-ME2）、4-羟基雌二醇（4-OHE2）、FSHR antagonist（FSH 受体拮抗剂）对卵泡血管生成及卵泡发育的影响，探测卵巢VEGF表达与FSH、E2及其代谢产物之间的协作调控关系。两周龄和六周龄小鼠分别分成 control、VEGF、E2、FSH、2-ME2、4-OHE2、FSH+2-ME2、VEGF+FSHR八组，腹腔注射各种药物（为了克服情期的影响，性成熟小鼠阴道涂片判明情期，发情后期开始注射），卵巢连续切片，然后经HE染色统计各级卵泡数量及其卵泡周围红细胞数目，并定量检测颗粒细胞中Flk-1,VEGF表达水平。结果表明：1)性成熟前卵巢发育对VEGF依赖性更强，FSH和VEGF存在协作;2) 性成熟前大卵泡的发育对FSH的依赖性更强，FSH和VEGF在大卵泡发育中存在协同作用,2-ME2等的抑制作用随着小鼠性成熟而逐渐减弱至消失;3)小鼠性成熟前后，FSH拮抗剂均能削弱VEGF的作用；4）随着小鼠性成熟，FSH和VEGF抑制小卵泡的发育，且两者的抑制作用具有协同效应；5）2-ME2、4-OHE2促进卵泡闭锁，而FSH则抑制卵泡闭锁，且2-ME2的闭锁作用可以在FSH作用下发生逆转；阻断FSH的作用在小鼠性成熟过程中均能使VEGF的作用减弱而导致更多的卵泡闭锁发生；6）E2的代谢物能抑制血管发育，而且在小鼠性成熟前FSH能拮抗这种抑制作用，FSH和VEGF能协同作用促进血管发育；7）阻断FSH的作用在小鼠性成熟前能使VEGF促进血管生成的作用减弱，增加FSH也能使2-ME2的抑制作用减弱，而在小鼠性成熟后增加FSH对2-ME2的拮抗作用有限；8）外源VEGF、FSH促进颗粒细胞目标基因表达，而且VEGF对目标基因表达的促进作用依赖于FSH，FSH的促进作用能够为2-ME2所抑制，4-OHE2抑制颗粒细胞中VEGF基因的表达。（4）卵母细胞中敲除GGPPs基因对小鼠生殖性能的影响采用Cre/Loxp系统成功获得了特异在卵母细胞内敲除GGPPs基因的小鼠。GGPPs基因敲除显著降低了小鼠的生育能力（妊娠率、产仔率）。为了研究GGPPs基因敲除影响小鼠生育能力的机制，我们分析了敲除鼠卵泡发育、卵子发育能力。GGPPs基因敲除不仅降低了自然状态下的卵巢重量，而且显著降低了PMSG注射48h和超数排卵后小鼠卵巢的重量，说明敲除鼠对激素敏感性显著降低；通过卵巢切片，卵泡计数发现，GGPPs基因敲除减少了自然状态下小卵泡（50-150m）和中卵泡（150-250m）数量，PMSG注射48h后卵泡计数发现敲除鼠不仅中、小卵泡数量低于对照组，而且大卵泡的数量（250m）也显著低于对照组，进一步证实敲除鼠对激素敏感性降低；对卵泡的电镜观察发现，GGPPs基因敲除影响了颗粒细胞与卵母细胞之间的连接，颗粒细胞不再伸出向卵母方向的细胞突出；Real-time RCR检测表明，GGPPs基因敲除对颗粒细胞凋亡相关基因（Fas L、Bim、Caspase 3）的表达没有显著影响；卵子方面的研究发现，GGPPs基因敲除不仅使超排后获得的卵母细胞数显著降低，而且降低了卵母细胞质量，即异常卵母细胞的比率显著增加，2-cell发育至囊胚的比率显著下降。 此部分试验证实，GGPPs基因敲除可能通过阻断颗粒细胞与卵母细胞之间的连接，降低卵泡对激素的敏感性，从而影响卵泡发育，进而降低卵母细胞数量和质量，使小鼠生育能力下降。（5）小鼠心理（束缚）应激模型的完善我们建立的束缚应激系统既能限制小鼠活动，又允许小鼠自由采食和饮水。最近对束缚应激小鼠的采食和饮水量进行了观察。结果发现，用我们的系统束缚小鼠24小时期间，采食量和饮水量都与对照组无明显差异。另外，由于我们用于束缚的小鼠笼就放在原有大笼子内，温度和光照等环境均未发生改变，基本克服了其他系统的弊端。（6）母体束缚应激对小鼠卵母细胞细胞染色体倍性影响的研究研究表明，人类大约有20%卵母细胞染色体出现非整倍体，而且随年龄的增长非整倍体比例更高。大多数的非整倍体卵母细胞形成的胚胎都不能存活，很少的存活下来便出现21三体（Trisomy 21，Down syndrome）。我们原来的研究（BOR, in press）证明，母体束缚应激削弱卵母细胞的发育能力，但具体作用机理不清楚。既然衰老能够导致卵母细胞染色体畸变，那么，心理应激是不是也会像母体衰老一样造成卵母细胞的非整倍性或者其它基因损伤？我们研究了母体束缚应激对小鼠卵母细胞细胞染色体倍性的影响。结果表明：（1）应激使胚胎发育速度放慢，囊胚率降低；（2）应激MII卵母细胞染色体非整倍体数目显著增多，但提前分裂不明显；（3）应激2-4细胞胚胎非整倍体增多，但混倍体不增加；（4）应激加快成熟进程，造成纺锤体组装异常；（5）应激卵MAD2在GV期显著高于对照，pMI低于对照，变化剧烈；（6）应激使还原型GSH减少，卵还原能力下降。总之，应激引起氧化应激，使纺锤体微管组装和MAD2表达异常，导致卵染色体倍性异常。（7）束缚应激对小鼠卵巢和卵母细胞凋亡影响的研究我们原来的研究证明，体内皮质醇升高能够不依赖下丘脑-垂体-性腺轴地降低卵母细胞发育能力，而体外添加生理浓度皮质醇并不影响卵母细胞发育能力。因此，皮质醇有可能是通过作用于卵巢上COC以外的其它组织而削弱卵发育能力的。于是，我们进行了以下研究。小鼠注射eCG后24 h开始应激24 h。应激后立即处死小鼠获取卵巢和血液进行实验。本研究证明，应激通过上调糖皮质激素（G）、CRH和CRHR1削弱卵发育能力。其机理如下：1）应激影响E2产生：CRH通过CRHR1抑制theca睾酮而抑制雌二醇；CRH下调MGC的IGF-1而抑制雌二醇；G抑制雌二醇。2）应激引发凋亡：E2减少引发凋亡；MGC的IGF-1下调或IGF-1分泌减少引发凋亡；卵母细胞产生CRH，卵丘细胞CRHR1上调引起培养过程中凋亡。3）应激影响卵发育能力：卵泡液雌二醇减少发育能力下降；IGF-1量减少造成的发育能力下降；卵丘凋亡降低卵发育能力。（8）葡萄糖代谢对卵母细胞老化调控研究结果证明（1）卵丘细胞葡萄糖代谢通过提供能量和降低氧化应激两种途径抑制卵母细胞老化；（2）卵丘细胞的糖酵解途径依赖PPP途径提供中间产物如6-磷酸果糖。（9）咖啡因抑制卵母细胞老化效率及可恢复性研究证明咖啡因能够通过维持MPF活性来可逆性地阻止卵母细胞老化，但不同类型卵母细胞要求不同最佳处理方案。（10）性成熟和促性腺激素对卵母细胞减数分裂调控作用信号通路的研究发现性成熟前小鼠卵母细胞MPF活性高，但减数分裂进程反而慢。进一步研究证明，造成MPF活性升高的关键是腺苷酸环化酶活性低而CDK1活性高；减数分裂进程慢主要是由于CDK1未能及时迁移到GV中。3. 如有重要阶段性成果或突破，请重点阐述（每项300-500字），另附图片。1）急性束缚应激对小鼠卵母细胞发育能力影响的研究应用自己建立的束缚应激系统对母鼠进行急性应激结果显示：（1）在卵母细胞生长和成熟阶段对母鼠进行束缚应激升高血清皮质醇水平，降低卵母细胞发育能力。（2）注射适当浓度皮质醇也降低卵母细胞发育能力。（3）自然发情小鼠束缚应激后卵母细胞发育能力的下降伴随血清皮质醇浓度升高和FSH水平下降，但注射皮质醇并不改变自然发情小鼠FSH水平。（4）超排小鼠尽管注射了过量的FSH，但束缚应激依然降低卵母细胞发育能力。（5）添加生理浓度Cortisol不影响卵母细胞体外成熟。（6）初步证明添加皮质醇诱发卵泡细胞产生胰岛素抵抗。这些都表明，皮质醇（甚至母体应激本身）对卵母细胞发育能力的损伤可能不依赖于HPG轴，而很可能是升高的皮质醇水平影响卵泡细胞对葡萄糖的利用，从而影响卵母细胞发育成熟。论文全文发表在Biology of Reproduction上。2）全基因组关联研究定位多囊卵巢综合征易感基因位点多囊卵巢综合症（PCOS）是一种常见的妇女代谢紊乱症。为了识别致病基因，我们以汉族女性为研究对象进行了PCOS的全基因组关联研究（GWAS）。研究对象包括744例PCOS患者和895名正常对照，随后的重复验证研究涉及两个独立的族群（PCOS患者2,840例和对照5012例来自中北部地区; PCOS患者498例和对照780例来自中国南部及中部地区）。我们提出了强有力的证据表明PCOS和三个位点之间的关联：2p16.3，2p21和9q