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第三组 乳粉中蛋白质的测定 DeterminationofproteinandaminoacidinFood 概述 1 蛋白质的元素组成 Theelementsofprotein C 50 55 N 15 18 O 20 23 H 6 8 S 0 4 微量元素 P Fe Zn Cu2 基本结构单位 氨基酸 蛋白质的测定方法 利用蛋白质共性的方法利用特定氨基酸残基法 凯氏定氮法杜马斯法 福林酚法染色法 蛋白质的定量测定 关于氮 蛋白质换算等数 6 25 6 25 6 38 5 95 凯氏定氮法 常量凯氏定氮法原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化 使蛋白质分解 其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出 而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵 然后加碱蒸馏 使氨蒸出 常量凯氏定氮是将消化后的消化液全部进行蒸馏后滴定 而微量凯氏定氮则是再稀释后取10ml进行蒸馏与滴定 2NH2 CH2 2COOH 13H2SO4 整个过程分三步 消化 蒸馏 吸收与滴定 消化 NH4 2SO4 6CO2 12SO2 16H2O 加硫酸钾作为增温剂 提高溶液沸点 加硫酸铜作为催化剂 消化终点指示剂 加氧化剂加速有机物氧化速度 蒸馏 NH4 OH NH3 H2O 用4 硼酸吸收 用盐酸标准溶液滴定指示剂 混合指示剂 甲基红 溴甲基酚绿 指示剂红色绿色红色 酸 碱 酸 吸收与滴定 反应式为 NH3 H3BO3 NH4 H2BO3 H2BO3 H H3BO3 用过量的H2SO4或HCl标准溶液吸收 再用NaOH标准溶液滴定过剩的酸液 1 装水至2 3容积处 加甲基橙数滴及硫酸数毫升以保持酸性 7 水蒸气蒸馏至指示剂变绿色开始计时 蒸馏10min 将管尖端提离液面再蒸馏1min 用水冲洗管尖后停止蒸馏 同时做空白 8 吸收液用0 01000mol LHCl标准溶液滴定至微红色为终点 2 管下端插入液面下 瓶内先装硼酸液及混合指示剂2滴 3 消化液10mL 4 NaOH溶液 5 水洗漏斗数次 6 夹好漏斗夹 水封 4 5 6步操作要迅速 微量凯氏定氮法 凯氏定氮仪 凯氏定氮仪 几种蛋白质测定方法比较 总氮量 蛋白氮 总氮量 蛋白氮 凯式定氮装置 分光光度计 高温装置 GC 分光光度计 浓硫酸 用量较少 不需要 福林 酚试剂 长 简单快速 3min 简单快速 实验操作 称取充分混匀的固体试样0 2g 2g 半固体试样2g 5g或液体试样10g 25g 约相当于30mg 40mg氮 精确至0 001g 移入干燥的100mL 250mL或500mL定氮瓶中 加入0 2g硫酸铜 6g硫酸钾及20mL硫酸 轻摇 记录数据 清理天平 PS 1 将天平置于稳定的工作台上避免振动 气流及阳光照射2 在使用前调整水平仪气泡至中间位置 3 电子天平应按说明书的要求进行预热 4 称量易挥发和具有腐蚀性的物品时 要盛放在密闭的容器中 以免腐蚀和损坏电子天平 5 经常对电子天平进行自校或定期外校 保证其处于最佳状态 6 如果电子天平出现故障应及时检修 不可带 病 工作 7 操作天平不可过载使用以免损坏天平 8 若长期不用电子天平时应暂时收藏为好 在使用前调整水平仪气泡至中间位置 注意 于瓶口放一小漏斗 将瓶以45 角斜支于有小孔的石棉网上 小心加热 待内容物全部炭化 泡沫完全停止后 加强火力 并保持瓶内液体微沸 至液体呈蓝绿色并澄清透明后 再继续加热0 5h 1h 取下放冷 小心加入20mL水 放冷后 移入100mL容量瓶中 并用少量水洗定氮瓶 洗液并入容量瓶中 再加水至刻度 混匀备用 同时做试剂空白试验 吸取10ml样液 胖肚移液管 至智能定氮仪消化管 吸取10ml硼酸溶液及2滴混合指示剂至250ml锥形瓶 打开开关 将消化管接入左侧 先加10ml水 再加10 20mlNaOH 接受瓶接入右侧 接收处打开蒸汽开关 待接收瓶内变色后 打开接收液按钮 5min后 关闭接收液按钮 冲洗右侧导管 1min后关闭蒸汽按钮 冲洗左侧按钮 关闭开关 2个平行 1个空白按上述方法操作 整理实验桌面 润洗滴定管 滴定 滴定开始 滴定终点 读数 记录数据 清洗实验器具 桌面 式中 X 试样中蛋白质的含量 单位为克每百克 g 100g V1 试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积 单位为毫升 mL V2 试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积 单位为毫升 mL V3 吸取消化液的体积 单位为毫升 mL c 硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度 单位为摩尔每升 mol L 0 0140 1 0mL硫酸 c 1 2H2SO4 1 000mol L 或盐酸 c HCl 1 000mol L 标准滴定溶液相当的氮的质量 单位为克 g m 试样的质量 单位为克 g F 氮换算为蛋白质的系数 一般食物为6 25 纯乳与纯乳制品为6 38 面粉为5 70 玉米 高梁为6 24 花生为5 46 大米为5 95 大豆及其粗加工制品为5 71 大豆蛋白制品为6 25 肉与肉制品为6 25 大麦 小米 燕麦 裸麦为5 83 芝麻 向日葵为5 30 复合配方食品为6 25 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示 蛋白质含量 1g 100g时 结果保留三位有效数字 蛋白质含量 1g 100g时 结果保留两位有效数字 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10 注意事项 1 所有实验用试剂溶液应用无氨蒸馏水配置 2 硫酸钾不宜加得过多 过多的硫酸钾会使沸点变高 使生成的硫酸氢氨分解 放出氨而损失 3 消化时 先低温加热 约20min 待泡沫减少和烟雾变白后再增加温度到最高温度的一半 约15min 再升至最高温度 消化至液体呈蓝绿色澄清透明后 再继续加热0 5h 取下 冷却至室温 4 蒸馏时 要注意蒸馏情况 避免瓶中的液体发泡冲出 进入接收瓶 另外 火力太弱 蒸馏瓶中压力减低 则接收瓶内液体会倒流 造成实验失败 5 硼酸吸收液的温度不应超过40 否则对氨的吸收作用会减弱而造成损失 6 所用盐酸可以用高浓度的盐酸稀释来减少系统误差 浓度最好为 0 1 0 0005 mol L 浓度高会减少每种样品的总滴定体积 滴定管读数的可读性及不确定性将会变大 重复性变差 7 称量时 称量在称量纸上后转移到消化瓶内 固体 固液混合型样品使用减量法称量样品 液体则用胖肚移液管移取 8 消化时 固定好消化管 电炉及试管架后 在消化管口放一个漏斗 开口朝里 不对着人 防止加热时 样品损失及气体大量冲出 该操作应在通风柜中进行 9 转移消化液时 少量多次用蒸馏水冲洗

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