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玉米淀粉的生物合成及其关键酶摘要： 淀粉是许多植物重要的储藏物质。近10年来，淀粉生物合成的研究进展很快，特别是对淀粉合成过程中的关键酶的研究比较深入，已经达到了分子水平。目前，许多研究结果揭示了玉米淀粉的生物合成涉及4类酶ADPG焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶和去分支酶，它们在淀粉的生物合成中发挥着不同作用。本文综述了玉米淀粉合成中4类关键酶的生理生化特性、分子生物学特性以及表达调控等方面的研究进展，并讨论了今后的可能发展方向，旨在为相关研究提供参考。关键词：玉米淀粉；生物合成；关键酶引言 淀粉是人类的主要食物来源之一， 也是化学工业的重要原料。玉米淀粉是最主要的淀粉产品，占据了国际淀粉市场80%以上的市场份额1。美国淀粉加工业95的淀粉是玉米淀粉，我国淀粉的主要生产原料也是玉米。玉米淀粉除了作为食品和饲料外，还被广泛用于制造酒精、纸张、粘合剂、生物降解塑料、建筑和包装材料。玉米淀粉有直链和支链之分，直链淀粉是D-葡萄糖基以 -(1，4)糖苷键连接的多糖链，支链淀粉分子中除有叫-(1，4)糖苷键的糖链外，还有-(1，6)糖苷键连接的分支。淀粉在不同领域中的应用取决于其分子结构，淀粉分子结构的重要参数包括: ( 1) 直链淀粉和支链淀粉的比例( 直/ 支比) ; (2 ) 直链淀粉的聚合度; ( 3) 支链淀粉分支链长及分布等等，这些参数影响淀粉加工的理化和功能特性。淀粉的理化性质主要包括: ( l) 淀粉凝胶化所需温度; (2 ) 凝胶化淀粉的赫性; ( 3) 长期保存或冻融过程稳定性。这些特性决定着其在食品和工业应用中的价值其中, 直/支比是淀粉分子结构最重要的分子结构参数, 例如, 普通玉米淀粉直/ 支比为1 ： 3 , 但是直/ 支比大于l 的高直链淀粉, 具有更快的凝胶化作用, 凝胶强度高, 作为食品添加剂在改善食品的质地和结构方面有独特效果许多类型的胶卷中用高直链淀粉, 是因其具有独特的透明性, 柔韧性, 拉伸强度及防水性目前人们对环保日益关注, 高直链淀粉生产的可再生可降解膜可以减少工业废气及减弱温室效应气体的释放, 正日益引起人们的兴趣。支链淀粉具有更好的勃性, 可增加膨化食品的体积, 作为食品添加剂具有不同于直链淀粉的效果, 在翻合剂领域具有较多应用此外, 那些介于直链淀粉和支链淀粉之间的中间成分, 其淀粉分支链的长度和分支程度等物理参数有所不同, 可能会有不同的理化性质, 因而有着不同的用途2。一 玉米淀粉的生物合成淀粉合成场所可以是叶绿体，也可以是淀粉体。叶绿体存在于光合器官如叶片中，淀粉体存在于非光合器官如胚乳中，它们的淀粉生物合成均有一系列的酶共同作用，但是也有很多不同之处。在叶绿体中(图一)，通过卡尔文循环固定C02，并形成3-磷酸甘油酸(3-PGA)，然后转化为磷酸丙糖(TP)。磷酸丙糖可以通过丙糖-磷酸易位体转运至胞液中，或在叶绿体中转变成6-磷酸果糖（F-6-P)，先后转变成6-磷酸葡萄糖(G-6-P)和1-磷酸葡萄糖(G-1-P)。G-1-P在ADP一葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase)作用下形成ADPG。所需的ATP来自光合电子传递链。ADPG可以作为淀粉合成的直接前体，在淀粉合成酶和分支酶作用下合成直链淀粉和支链淀粉3。在胚乳中(图二)，叶片中合成或淀粉降解产生的蔗糖作为合成淀粉的碳源，它通过韧皮部长距离运输至贮藏器官，在胞液中蔗糖合成酶的作用下分解为果糖和UDP-葡萄糖(UDPG)，继而形成6一磷酸葡萄糖(G-6-P)或1一磷酸葡萄糖(G-1-P)。G-6-P或G-1-P进入淀粉体，再通过AGPase催化其与ATP反应生成腺苷二磷酸葡萄糖参与淀粉合成。在淀粉合成最后阶段有三个关键的调控酶：淀粉合成酶(Starch synthase，SS)、淀粉分支酶(Starch branching enzyme，SBE)及去分支酶(Starch debranching enzyme，SDBE)的催化下合成直链淀粉和支链淀粉。SS的主要功能是催化G-1-P以-1，4糖苷键连接起来，形成直链淀粉或延伸支链淀粉的分支链。直链淀粉主要是由颗粒结合型淀粉合成酶催化合成，而支链淀粉是由可溶性淀粉合成酶(SSS)、SBE、SDBE三种酶协同催化形成，其中SBE催化葡聚糖链中1，4糖苷键的断裂，并将释放出的寡葡聚糖链的还原端连接到另一葡聚糖链的一个葡萄糖残基C-6羟基上，形成一个新的-1，6糖苷键，产生一个分支，因此它是支链淀粉合成中非常关键的一种酶，对淀粉的品质具有重大的影响。然后SDBE对淀粉分支酶产生的分支进行修饰，最后合成具有一定结构特性的淀粉结晶体。叶片和胚乳中淀粉的生物合成途径相同之处在于G-1-P至淀粉合成步骤和催化反应的酶相同，特别是一些与淀粉合成有关酶的基本酶学特点相同。图一： 图二： 二 淀粉合成的关键酶1 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶AGP存在于叶片和种子中, 是影响淀粉合成速率的关键因子。叶片中AGP主要存在于叶绿体膜上，受异构化调节,3一PGA 激活, 无机磷(P i)抑制2。胚乳AGP 在不同物种的种子中的定位及调控有所不同, 如马铃薯、大豆的AGP 酶存在于造粉体, 玉米、大麦、水稻的存在于细胞质中; 马铃薯、玉米胚乳中AGP 酶均受到3-PGA 和Pi相对比率的调节, 但在小麦、大麦胚乳中该酶不受此调节。AGPase 分为胞质型与质体型两种。在大多数植物细胞中, AGPase 主要是质体型, 但在禾本科植物的胚乳中, AGPase 主要是胞质型。AGPase 是一个异源四聚体, 由两种结构不同的亚基组成, 其中两个小亚基（SSU）的分子量在50 000 55 000之间, 两个大亚基(LSU)的分子量在51 000 60 000之间。在功能上, 大亚基是酶活性的调节中心, 主要增加小亚基对激活因子的亲和性, 降低小亚基对抑制因子的亲和性。而小亚基则是酶活性的催化中心, 是酶别构效应的关键部位, 对淀粉的合成起关键作用4。玉米AGPase的LSU 突变体Sh 2与SSU 突变体Bt2内AGPase活性下降了90% 95%, 淀粉含量降低了75%5。AGPase是合成淀粉的限速酶。Espada 在发现ADP glucose( ADP Glc) 焦磷酸化酶时指出，其是催化淀粉合成第一步反应。Thai等6通过试验提出玉米淀粉合成产生是通过如下反应得到: ATP + glucose 1-P = ADP-glucose +PPi。后来相继发现，反应中的葡萄糖从蔗糖分解后，再通过AGPase 等一系列催化反应后淀粉合成所利用7，在玉米胚乳中，运输到胞质蔗糖先经蔗糖合酶的分解，产生的果糖和UDPG 分别由磷酸变位酶和UDPG 焦磷酸化酶反应形成AGPase 的反应底物-glucose 1-P( G1P) ，形成ADP-glucose( ADPG) 后，转移到造粉体中，再进一步生成淀粉。2 淀粉合成酶在玉米中淀粉合成酶(starch synthase ,SS)主要有GBSS，SSI，SSIIa，SSIIb，SSIII，SSIV 等6 种同工型8，可分为2 大类，即可溶性淀粉合成酶（SSS）和颗粒结合淀粉合成酶(GBSS)。SSS主要与淀粉分支酶共同作用合成支链淀粉。GBSS与淀粉颗粒紧密结合，作物籽粒中主要起催化作用的GBSS是指由waxy基因编码的GBSS I，它是与直链淀粉合成直接有关的酶9。SS是植物淀粉合成的关键酶，与淀粉的含量、直链淀粉与支链淀粉的比例、支链淀粉的链长分布和淀粉粒的结构直接相关。淀粉合成酶以寡聚糖为前体，ADPG为底物，通过-l，4糖苷键不断增加寡聚糖的葡萄糖单位，最终合成以一1，4糖苷键连接的多聚糖，该产物又作为SBE的底物合成支链淀粉。3 淀粉分支酶SBE 的分子量一般在70 114 kD 范围内。依据酶的结构、底物专一性和免疫反应等特点，SBE可分为两类：同工型A和同工型B。玉米的SBEa、SBEIIb属于同工型A，玉米的SBEI属于同工型B。对比同工型A和同工型B的氨基酸序列发现，同工型A比同工型B多出一个额外的N-末端区域，通常以3个连续的脯氨酸结尾，这个额外的N-末端区域具有高度的可塑性，推测它在决定与其它酶的相互作用或决定酶的作用底物等方面起作用。据研究表明，N-末端结构域决定链长转移的专一性，而C-末端结构域参与底物的特异性10。在离体条件下，观察到SBE同工酶在支链淀粉生物合成中所起的作用不同。同工型A类的SBE作用的底物为支链淀粉，能使较短的糖苷键转移到支链淀粉上；而同工型B对直链淀粉的亲和力更高，在玉米中SBEI在直链上产生分支的效率是在支链上产生分支的十倍以上9。SBE具有双重功能，一方面切开-1,4-糖苷键连接的葡聚糖，另一方面对切下的短链通过-1,6 糖苷键连接在受体上。SBE 通过水解直链淀粉的-1,4- 糖苷键, 把切下的短链转移到C-6 氢氧键末端, 形成-1,6 糖苷键, -1,6 糖苷键连接形成支链淀粉的分支结构。4 淀粉去分支酶淀粉去分支酶(Starch debranching enzyme，SDBE)，能水解支链淀粉的一1，6糖苷键，对淀粉的结构起“修饰”作用，根据它们作用的底物不同可将其分为两类：直接去分支酶和间接去分支酶。间接去分支酶存在于动物及酵母中，通过与4-葡萄糖转移酶及淀粉-1,6-葡萄糖转移酶的共同作用去除-l,6连接。直接去分支酶存在于细菌及植物中，可直接去除-1,6糖苷键。直接去分支酶根据作用底物不同又可分为两种：极限糊精酶或称R酶(Limit dextrinase；R enzyme，RE)和异淀粉酶(Isoamylase，ISA)。极限糊精酶以极限糊精为底物，特异去除它们的-1，6糖苷键；而异淀粉酶则以支链淀粉或糖原为底物，去除它们的-1,6糖苷键，它不能作用于极限糊精9。DBE 主要催化多糖链中-( 1-6) 糖苷键的水解, 在淀粉合成中起最后的修饰作用。改变DBE活性可改变直、支链淀粉的比例, 而且还可改变支链淀粉的结构, 形成分支程度不一的支链淀粉, 从而赋予淀粉新的理化特性。它的两种同工酶的功能分别是: ISA 主要水解支链淀粉和糖原的-1,6-糖苷键, 但不能作用于极限糊精, 它在支链淀粉合成中起着主要作用。其中ISA-1 和ISA-2 具有相似的催化活性, 它们构成一个复合体, 共同分枝可溶性葡聚糖, 而ISA-3 所起的作用与它们不同,可能主要参与淀粉的运转11 。ZPU 主要水解极限糊精, 但不能作用于糖原, 它在淀粉合成过程中起着某种程度的补偿作用, 与ISA 的功能并不重叠12 。目前, 有关DBE 在支链淀粉合成中的作用机理主要有2 种假说13 , 一种是以Erlander14 为代表,认为植物糖原( Phytog ly cogen, PG) 是支链淀粉合成的中间产物, 经过DBE的作用形成支链淀粉。另一种以Nakamura 和Yuki15 等为代表, 认为SBE 和DBE 这2种酶的酶活性平衡对- 1, 6- 分支酶的频率或支链淀粉的- 1, 4- 侧链的链长的分配有着重要的决定作用16。之后，有人认为上面2 种假说其本质是一致的, 只是着眼点不同。前一假设是以DBE 的底物为着眼点,而后一假设则是以SSS、SBE、DBE 3 种酶的协同作用为着眼点, 并且这2 种假说彼此是相互补充的。5 淀粉合成过程中酶之间的互作及磷酸化反应 淀粉的合成是一个复杂的生理生化过程，需要不同酶的协同参与。Gao 等17从玉米转座插入突变体中筛选到dul突变体。该突变体胚乳中SSII 和SBEIIa 的活性下降，胚乳中直链淀粉含量、中间类型的淀粉含量以及支链淀粉的分支度显著提高。于是认为du1 是玉米胚乳淀粉结构的决定因子之一。Cao 等18发现在发育的玉米胚乳中大部分的SS 活性由DU1 和zSSI 表达的，在淀粉合成过程中2 种同工酶的相对活性并没有显著改变。在缺乏DU1的突变体中发现其对剩余的SS 有显著的刺激作用，认为DU1 和zSSI 相互补充。 在催化淀粉合成过程中, 与淀粉合成相关的几个关键酶还需经历磷酸化过程。Telow 等19 发现完整的质体经-32P-ATP培养后, 在检测出的质体可溶性磷酸蛋白中, 造粉体的BE、BE a与BE b及叶绿体的BE与BE a均发生磷酸化反应, 位点在ser(丝氨酸)残基上; 在颗粒结合磷酸蛋白中,BE和两个SS(包括SS a)也发生了磷酸化反应。磷酸化能提高造粉体与叶绿体BE a及造粉体BE b 的活性, 去磷酸化则降低这些酶的活性。三 展望 随着生物技术的迅速发展，人们对植物玉米淀粉的生物合成机理、关键酶的生化特性、表达调控等方面有了很大的突破。但现今玉米淀粉生物合成方面仍有许多问题有待进一步的研究。如：1. 如各个同工酶之间的互作关系以及它们对淀粉结构形成的调控机制还未完全清楚; 2.各个同工酶基因转录后调控对淀粉合成影响的研究甚少；3. 除了这四种酶以外其它较重要的酶( 如异化酶、磷酸化酶、淀粉酶等) 是否参与淀粉的合成,目前尚未有明确的结论。4.四类关键酶是如何相互作用的？因此，关于玉米淀粉的生物合成还有待我们更加深入的研究。参考文献1陈国清，陆大雷，陆卫平.玉米胚乳淀粉合成研究进展.中国农学通报，2014,30：8-15.2张红伟，谭振波，陈荣军，等.玉米淀粉生物合成及其遗传操作.遗传HEREDITAS(Beijing),2003,25:455-460.3彭信松，郑志仁，刘涤，等.淀粉的生物合成及其关键酶.植物生理学通讯，1997,33:297-303.4谭彩霞，封超年，陈静，等.作物淀粉合成关键酶及其基因表达的研究进展.麦类作物学报，2008,28：912-919.5康国章，王永华，郭天财，等.植物淀粉合成的调控酶.遗传HEREDITAS(Beijing),2006,28:110-116.6Tsai C,Nelson O.Starch deficient maize mutant lacking adenosine diphosphate glucose pyrophosphorylase activity.Science, 1966, 151: 341343.7Creech R . 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