高锐--铁线莲的组织培养(修改).doc

兰州交通大学化学与生物工程学院细胞工程课程报告题目：铁线莲组织培养的研究进展作者：高锐学号：201207724指导教师：谢放完成日期：2014-12-3铁线莲组织培养的研究进展高锐 201207724摘要：本文简单介绍了铁线莲的特性、应用与价值，以及植物组织培养的定义。从外植体的选择与处理，培养基的选择，生长与分化情况以及组织培养中存在的问题这四个方面介绍了铁线莲组织培养的研究进展。最后对铁线莲的发展及应用前景做出评价及展望。关键词：铁线莲 组织培养 外植体 愈伤组织 1 引言 铁线莲为毛茛科、铁线莲属植物，多数为落叶或常绿草质藤本，花期从早春到晚秋（也有少数冬天开花的品种），果期夏季，有若干个种、变种及其品种和杂交种，可栽培供园林观赏用，具有很强的观赏性1。铁线莲作用广泛，铁线莲可作展览用切花，可用于攀缘常绿或落叶乔灌木上，也是优良的垂直绿化材料和地被植物，也广泛用于盆栽、切花等，但目前在我国园林中应用尚少；以根及全草入药，具有利尿、理气通便及活血止痛的作用，可用于小便不利，腹胀，便闭；外用可治关节肿痛，虫蛇咬伤2。植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术。广义是指从植物体分离出符合需要的组织。器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义是指组培指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物3。铁线莲的观赏价值及药用价值使它具有极大的应用前景，然而其种子繁殖却较为困难，因此常采用组织培养来繁殖。2 外植体的选择与处理2.1 外植体的选择通过近几年的试验，分别采用了铁线莲的叶片、花、顶芽及茎等作为外植体进行接种培养，筛选出适宜的外植体为未木质化的茎段。采样时间宜选在3-5月份铁线莲生长旺盛时期，否则铁线莲很快木质化不利于愈伤组织的诱导4。此外，外植体的处理也非常重要，试验前后分别采用了从自然环境下采取的嫩枝和放到室内弱光处理7-10d新抽出的嫩枝作为外植体，结果表明，经过室内弱光处理新抽出的嫩枝生长比直接从自然条件下采回的嫩枝更容易诱导出愈伤组织。自然条件下处理的外植体需要30d左右才能诱导出愈伤组织，而经过处理的嫩枝2周就能诱导出愈伤组织5。2.2 外植体的消毒选好的嫩枝在自来水下清洗干净后，用70%-75%的酒精浸泡处理5s，再用0.1%的升汞消毒处理8min，无菌水冲洗干净后将枝条切成1cm左右的茎段接种于培养基中6。3 培养基的选择3.1 选择依据不同培养基所诱导出的愈伤组织是明显不同的。低浓度下2，4-D、6-BA及IAA三者同时使用的培养基，愈伤组织在茎段顶端诱导出，呈绿色致密的形态，不利于下一步的分化培养7。2，4-D在1.0-3.0mg/l的浓度范围内单独使用时，愈伤组织在茎段的中部形成，呈白色膨松的形态。随2，4-D浓度的增大，愈伤组织诱导率越高，能达到80%左右，但浓度越大，愈伤组织也越膨松，也不利于愈伤组织诱导8。因此，单独使用2，4-D时，不仅要考虑愈伤组织的诱导率，还要考虑愈伤组织的松紧度。6-BA在1.0-3.0mg/l的浓度范围内单独使用时，愈伤组织在茎段的顶端形成，呈浅绿色致密状态，但比低浓度下2，4-D、6-BA及IAA三者配合使用时显疏松9。随6-BA浓度的增大，愈伤组织诱导率也出现增大的趋势，但没2，4-D的诱导率高，仅能达到30%，且转接时间宜在培养2-3周时开始转接，否则易产生褐变。从近几年的试验情况来看，在1.0-3.0mg/l的浓度范围内，6-BA诱导出的愈伤组织，6-BA浓度越低，发生褐变的时间越短10。因此，单独使用6-BA时，可考虑再加大浓度的使用范围。以上是近几年的试验研究中诱导出的三种不同形态的愈伤组织，究竟何种愈伤组织及培养基更易分化培养形成铁线莲的组培苗还有待进一步的探索研究11。3.2 选择方案 诱导培养基的选择：(1)MS+6-BA0.5mgL-1(单位下同)+NAA0.05+3%蔗糖；(2)MS+6-BA0.5+NAA0.1+2，4-D0.1+3%蔗糖；(3)MS+6-BA2.0+NAA0.1+3%蔗糖12。 增殖分化培养基的选择：(4)MS+6-BA1.0+NAA0.1+3%蔗糖；(5)MS+6-BA2.0+NAA0.1+2，4-D0.01+3%蔗糖；(6)MS+6-BA2.0+NAA0.05+3%蔗糖13。 生根培养基的选择：(7)1/4MS+NAA0.5+0.1%活性炭+15%蔗糖14。 外界环境的选择：培养基均附加0.6%琼脂粉，pH5.86.0，培养温度为(252)，光照强度为3040mmolm-2s-1，光照时间为14hd-115。4 生长与分化情况4.1 无菌材料的获得 铁线莲的幼嫩枝条用自来水冲洗23h。在超净工作台上用70%乙醇浸泡10s，转入0.1%升汞溶液消毒(其中茎段和叶片的处理时间分别为5min和3min)，最后用无菌水冲洗56次。剪取幼嫩带芽茎段、叶片和节间接种16。4.2 愈伤组织及芽的诱导 将带芽茎段接种在培养基(1)上，接种7d后，腋芽开始萌动，20d后长成12cm高的小芽苗，每个节上有12个侧芽，诱导率可达90%17。将叶片接种在培养基(2)上，接种10d后，叶片缺口处开始产生浅绿色愈伤组织，20d时诱导率可达80%以上。将节间接种在培养基(3)上，接种10d后，节间两端膨大且缺口处开始产生黄绿色至绿色愈伤组织，30d时诱导率可达83%18。4.3 继代增殖与不定芽的诱导 将带芽茎段诱导的有效芽转移到培养基(4)上进行增殖培养，2030d可增殖一代，增殖系数约为3。将叶片和节间诱导的绿色愈伤组织先接种到培养基(5)上进行增殖，增殖2030d后转移到培养基(6)上诱导分化，继代23次后愈伤组织开始分化出黄绿色的小芽丛19。养基(7)上进行生根培养。10d后开始生根，30d时的根最长可达6cm，每棵苗最多有7条根，生根率为86%20。4.4 炼苗移栽 将生根苗放在室温下培养3d，揭开封口膜后于室内再培养3d，取出生根苗洗去根部培养基，移栽到温室中，育苗基质为珍珠岩、蛭石和腐殖土(1:1:2)，湿度保持在85%以上，10d时开始有新叶长出，30d时的成活率为75%21。5 组织培养中存在的问题 (1)2，4-D与6-BA两种生长调节剂配合使用的培养基均未能诱导出愈伤组织，说明这两种物质在铁线莲的诱导中有拮抗作用，不宜一起使用22。但这两种植物生长调节剂低浓度下配合IAA使用能诱导出愈伤组织，说明在铁线莲幼嫩茎段的愈伤组织诱导中，2，4-D和6-BA配合IAA使用，能降低或消除两者之间的拮抗作用。结合前面的试验情况，今后的研究中可考虑从同时使用高浓度的2，4-D和6-BA时，加入一定浓度的IAA或其他生长调节剂，以降低甚至消除两者之间的拮抗作用，观察其诱导愈伤组织的诱导率、速度、形态，探索适宜的植物生长调节剂的种类及其比例23。 (2)在高浓度下2，4-D与6-BA单独使用均能诱导出愈伤组织，但诱导出的愈伤组织形成的部位及形态有较大差异，究竟哪种愈伤组织更有利于分化培养，这是今后工作开展的一个重点24。除观察愈伤组织的形态外，还应从分析各种不同愈伤组织的成分及其细胞的微观结构入手，深入研究和探讨植物生长调节剂的种类、浓度与愈伤组织之间的机理、联系，为今后合理使用植物生长调节剂奠定理论基础25。 (3)外植体的选择和处理已找到适宜的方法，但适宜的培养条件还有待进一步深入细致的研究。近几年的试验培养条件仅采用了一般植物组织培养常用的温度、光照强度及光照时间，但这究竟是不是铁线莲最适宜的培养条件，还有待今后的试验进行探索和研究26。 (4)在近几年的实验研究中主要采用的MS培养基，在今后的研究工作中亦可尝试利用其他培养基配方，调整各种元素的比例，比较分析最适的铁线莲愈伤组织诱导或直接分化成苗的基本培养基27。 (5)近几年的试验研究工作还未完善，还需从以下两方面继续研究和完善:一、愈伤组织诱的诱导分化，生根应采用何种培养基;二、铁线莲组培苗的驯化移栽，如何保证和提高其组培苗的移栽成活率28。只有研究出线莲成苗的方法和成活率较高的移栽驯化方法，铁线莲的整个植物组织培养技术体系才完善，也才能推广应用到生产上，为其开发利用奠定坚实的基础29。 (6)铁线莲的组织培养，目的是使其快速繁殖。成苗的途径除经过诱导愈伤组织，进一步使愈伤组织分化成苗外，还可经过外植体直接成苗的途径，即相当于微扦插，这样可节省成苗的程序和时间，同时也能达到快繁的目的30。但在近几年的试验中，也没找到外植体直接成苗的方法，因此，这也是今后研究工作的一个重点31。6 评论与展望 铁线莲具有较大的开发前景和利用价值，但由于其常规繁殖方法繁殖率低， 因此利用组培快繁技术对其进行快繁迫在眉睫。但目前研究铁线莲组培技术的资料较少，且目前还没有完整的、成熟的技术体系，只能参考单一品种，如红花铁线莲，绿花重瓣铁线莲等进行，但各种铁线莲生长的环境条件不同，品性有差异， 故每个品种的技术方法基本不能全部套用。从近几年的研究的情况来看，利用组织培养技术快速繁殖铁线莲是可行的，相关的研究成果也陆续出现，但仍然还有大量的工作需要进行探索和研究，而要真正地全面运用到生产上仍需要很长时间。7 参考文献1 倪新，马毓。红花铁线莲(Clematis coccinea)的组织培养J。植物学通报，2013 年2 王文采。中国植物志M。北京: 科学出版社。2014年3 泽仁旺姆，尼珍，潘多。西藏甘青铁线莲的再生植株J。西藏科技。2013年4 张启香，方炎明，吕梅，陈娜铁线莲“Multi-Blue”不定芽及体细胞胚发生的 初步研究J。园艺学报。2013年 5 张涛，周琼，张丽琼，屈国胜，廖咸康。重瓣铁线莲愈伤组织诱导研究J。安徽农业科学。2013年6 廖咸康，龚小松。珍贵的绿花重瓣铁线莲J。花木盆景(花卉园艺版)。2014 年7 倪新，马毓。红花铁线莲的组织培养J。植物学通报，2013年8 张启香，方炎明，吕梅等。铁线莲“Multi-Blue”不定芽及体细胞胚发生的初 步研究J。园艺学报，2012年9 周琼，张丽琼，屈国盛等。重瓣铁线莲组织培养研究J。陕西农业科学，2013 年 10 中国科学院中国植物志编辑委员会。中国植物志M。北京：科学出版社， 2014年11 蔡艳飞，李世峰，李涵等。中国铁线莲属植物研究进展J。中国农学通报， 2012年12 倪新，马毓。红花铁线莲的组织培养J。植物学通报，2013年13 泽仁旺姆，尼珍，潘多。西藏甘青铁线莲的再生植株J。西藏科技，2012年14 吴荣等。铁线莲里昂城的组织培养研究J。现代农业科技。2013年15 张启香，方炎明，吕梅等。铁线莲“Multi-Blue”不定芽及体细胞胚发生的 初步研究J。园艺学报，2014年16 李淑瑜。大叶女贞快繁体系研究D。河南：河南农业大学，2013年17 李顺平。黄山贡菊优质高产栽培技术J。现代农业科技，2011年18 罗益珍，吴卫章，赖淑华等。贡菊的繁育及栽培管理技术J。中国园艺文 摘，2013年19 柯紫英。菊栽培技术J。现代农业科技，2012年20 丰玉成，余宜顺，何建江。贡菊主要病虫害及综合防治技术J。杭州农业 与科技，2013年21 吴荣等。铁线莲“茱莉亚”的组织培养研究J。现代农业科技。2012年22 中国科学院植物志编辑委员会编。中国植物志。( 第二十八卷) M。北京: 科 学出版社， 2012年23 刘庆昌， 吴国良主编。植物细胞组织培养M。北京:中国农业大学出版社， 2012年24 谭文澄， 戴测刚。观赏植物组织培养技术M。北京:中国林业出版社。2013 年 25 王磊，汤庚国。铁线莲属植物资源及其园林应用J。林业科技开发，2