鸡胚原代细胞培养.doc

鸡胚原代细胞培养 实验材料910日龄鸡胚，Hanks液50mL，05水解乳蛋白液或MEM培养液20mL(内含犊牛血清1mL，双抗02mL，pH72)，O25胰蛋白酶5mL、7NaHC031mL，手术剪，镊子，灭菌的培养皿，50mL三角瓶，滴管若干，链霉素小空瓶若干(加入细胞悬液培养用)，高压灭菌塞子若干，培养盘，蛋座，95酒精，水浴锅。实验内容及操作程序1配液制备细胞前先在Hnaks液中加青、链霉素，使其含量为青霉素100IU/mL，链霉素100g/mL，用7NaHC03调整pH至7274，将胰蛋白酶调整pH76(玫瑰红色)。置37水浴锅中预热备用。2. 取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。剪去头部、翅爪及内脏，用Hanks液(简称H液)洗去体表血液，移人灭菌三角瓶中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使成为约1mm3大小的碎块，加5mL H液轻摇，静止12min，使其组织块下沉。吸去上层悬液，依同法再洗2次，至上悬液不混浊为止，吸干H液留组织。3消化自水浴锅内取出预热的胰酶，按组织块量约35倍加入三角瓶中，1个鸡胚约需5mL胰酶，三角瓶上加塞，以免CO2挥发及污染。37水浴约20min左右，每隔5min轻轻摇动1次，由于胰酶作用，使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，待液体变混而稍稠，此是再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时，则需中止消化，如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。4洗涤取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉后，吸去胰酶液，用10mL Hanks液反复轻洗3次，以洗去胰酶，吸干上清液，留组织块。5吹打加2mL含血清的05水解乳蛋白营养液或：MEM培养液，以粗口吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见营养液混浊即为细胞悬液。静置1min，使未冲散的组织块下沉后，小心地将细胞悬液吸出1mL于20mL营养液中，此液细胞数约50万70万/mL。如需大量细胞，可继续加营养液冲打，一个鸡胚约可做100mL细胞悬液。6细胞计数取上述细胞悬液05mL加入01结晶紫一柠檬酸(0.1mol/L)溶液2mL，置室温或37温箱中510min，充分振动混合后，用毛细管吸取滴人血细胞计数板内，在显微镜下计数。计数方法按白细胞计数法，计算四角大格内完整细胞的总数。如35个聚集在一起，则按1个计算，然后将细胞总数按下法换算成每毫升中的细胞数。细胞数/mL=4大格细胞总数/410 000稀释倍数例如：4大格的细胞总数为284个，而稀释倍数为5(05mL染色液)，则每毫升细胞悬液的细胞数为284/410 0005=35104个。7稀释按照每毫升50万70万个细胞密度的标准，将细胞悬液用营养液稀释之。(计数时，可见到大部分细胞完整分散，35个细胞成堆，且细胞碎片很少，说明消化适度；如分散细胞少，则消化不够；如细胞碎片多，则消化过度。)活细胞计数法取2台盼蓝溶液1滴，细胞悬液1滴，混合计数，活细胞不着色，死细胞呈蓝色。8分装培养分装于链霉素瓶中，每瓶约1mL，瓶口橡皮塞要塞紧。不合适者弃去，以免漏气造成污染或C02跑掉而营养液变碱。将细胞瓶横卧于培养盘中，于瓶上面划一直线，以表示直线的对侧面为细胞在瓶内的生长位置。瓶上注明组别、日期，置37温箱培养，4h后细胞即可贴附于瓶壁，2436h生长成单层细胞，此时可吸去培养液，更换维持液，并接种病毒。附：细胞培养所需的常用培养基与试剂1Hanks液配制原液甲NaCl 8gKCl 2gMgSO47H20 2gMgCl26H20 2g28CaCl2 100mL双蒸水 加至1 000mL先将固体成分加于800mL双蒸水中，加温到5060加速溶解，再加入CaCl2溶液，最后加双蒸水补足到1 000mL。加氯仿2mL，摇匀后于4贮存。原液乙Na2HPO42H20 1.2gKH2PO42H20 1.2g葡萄糖 20g04酚红 lOOmL双蒸水 加：1 000mL将上列各物混合后使其溶解，加氯仿2mL，摇匀后于4贮存。Hanks工作液原液甲 1份原液乙 1份双蒸水 18份工作液分装100mL，或500mL盐水瓶中，115C灭菌10min，使用前以7NaHCO3调节pH至0 7276。204酚红溶液配制酚红 0.4g01NaOH溶液 11.28mL将酚红置于研钵中，加磨边缓缓加NaOH溶液，直到所有颗粒完全溶解，置于至lOOmL量杯中，最后加双蒸水至lOOmL，摇匀后，保存于4冰箱内备用。3. 0.5乳蛋白水解物溶液配制乳蛋白水解物 5gHanks液 l 000mL将乳蛋白水解物放入1 000mL Hanks液中，待完全溶解后，摇匀分装于lOOmL的盐水瓶中，每瓶95mL，115 lOmin灭菌，4贮存备用。4营养液(生长液)配制O5乳蛋白水解物 95mL犊牛血清 5mL青霉素、链霉素 lmL将上述溶液混合后，以7NaHCO3适量调节pH到7.27.4。维持液按上述方法，加犊牛血清2.5mL即成。5MEM培养液MEM培养基一袋，加1 000mL双蒸水，过滤除菌或高压灭菌，分装于100ml盐水瓶中，每瓶90ml，用前以 7NaHC03调pH到7.27.4，并加10犊牛血清。6双抗配制青霉素 100万IU链霉素 1gHanks液 100mL将青、链霉素溶解于：100mL Hanks溶液中，此为双抗溶液，无菌操作，分装小瓶，每瓶：lmL，内含有青霉素IIU，链霉素10000g，低温冻结保存。使用时每100mL营养液中加双抗lmL，即每mL营养液中含青霉素100IU，链霉素100gg。7. 7 NaHCO3溶液配制NaHCO3 7g双蒸水 100mL将NaHC03溶于双蒸水中，置水浴锅中加热溶解，115 10min灭菌后，无菌操作分装小瓶，每瓶l