粪大肠杆菌检测作业指导书.doc

粪大肠杆菌检测作业指导书 粪大肠杆菌检测作业指导书1.试剂及培养基配制1.1试剂配制a)溴甲酚紫乙醇溶液称取1.6g的溴甲酚紫溶于23ml乙醇中，然后用蒸馏水定容到100ml。 b)碳酸钠溶液称取10.6g碳酸钠溶于蒸馏水，并定容到100ml。 1.2培养基的配制1.2.1乳糖蛋白胨培养液a)成分蛋白胨10.0g；牛肉膏3.0g；乳糖5.0g；氯化钠5.0g；溴甲酚紫乙醇溶液1ml；蒸馏水1000ml。 b)制法将规定量的蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，用碳酸钠溶液调节PH为7.27.4。 加入1ml溴甲酚紫乙醇溶液，混匀，分装于置有倒管的试管内（10ml左右）。 置高压蒸汽灭菌器中，于115灭菌20min。 1.2.2EC培养基a)成分胰蛋白胨20.0g；乳糖5.0g；胆盐混合物1.5g；磷酸氢二钾4.0g；磷酸二氢钾1.5g；氯化钠5.0g；蒸馏水1000ml。 b)制法将上述成分加热溶解，分装于内装倒管的试管中。 灭菌后PH值应为6.9。 此培养基用钱不宜置冰箱，以防检测时出现假阳性。 2.样品采集2.1样品瓶应用可耐灭菌处理的广口玻璃瓶或无毒的塑料瓶。 灭菌前，把具有玻璃瓶塞得采样瓶用铝箔或厚的牛皮纸包裹，瓶颈系一长绳，在121经15min高压灭菌。 2.2水样采集开瓶塞时，要连同铝箔一起拿开。 手执长绳的末端，将采样瓶投入选定点的海水内，采集水下约10cm处水样。 采好的水样需盖紧瓶塞，编号瓶号，按表所列项目记录。 水样在瓶内要留下足够的空间以备在检验前摇荡混匀。 该法适用于沿岸水域的采集。 2.3泥样采集用小型底栖生物柱状采泥器或弹簧采泥器采集泥阳，采泥器出水后，在预先选定的泥层中用无菌刮板取一定量的样品置于灭菌容器中。 2.4样品保存和储藏采集的水样和泥样应立即送检，时间不超过2h，否则，应将样品置于冰瓶或冰箱中，但不得超过24h，否则影响检验结果。 3.检验步骤3.1初发酵试验a)以无菌操作方法，等量吸取10ml经充分摇匀的水样，分别加入5支各盛有5ml已灭菌的三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中。 b)等量吸取1ml水样，分别加入5支盛有10ml已灭菌的普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中；c）吸取1ml样注入盛有9ml已灭菌清洁海水的试管中，摇匀。 另换一吸量管等量吸取此种稀释水样1ml，分别加入5支盛有10ml已灭菌的普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中；d)将上述15支试管充分混匀后，置于44恒温箱中培养24h。 3.2复发酵试验a)经培养24h后，将产酸产气及只产酸的发酵管，用一无菌环接入EC培养液后总，摇匀后置440.5恒温箱中培养242h。 在此期间内所得的产气阳性管即证实有粪大肠杆菌群存在；b)依据阳性管数查表，即可得每100ml水样中粪大肠杆菌的最近似值，此数值再乘以10，即求得每升水样中粪大肠菌群数；c）若海水水样污染较严重，接种后15管全部产酸产气时，可将接种量减少十分之一，即1ml5管，0.1ml5管，0.